第二章__生物工具酶2.ppt

1、第二章 基因克隆的酶学基础,概述 第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶与体外连接 第三节 DNA聚合酶 第四节 DNA及RNA的修饰酶 第五节 其他工具酶,几种酶的定义,工具酶：在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。 核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核苷酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。,核酸酶按其水解断裂核酸分子的不同方式，可分为两种类型：核酸外切酶和核酸内切酶 核酸外切酶：从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链。 核酸内切酶：从核酸分子内部切割磷酸二

2、酯键使之断裂形成小片断。,常用的工具酶,工 具 酶 名 称 主 要 功 能 限制性内切核酸酶 在DNA分子内部的特异性的 碱基序列内部进行切割； restriction endonucleases DNA连接酶 将两条以上的线性DNA分子或片段 催化形成磷酸二 DNA ligase 酯键连接成一个整体 ； DNA聚合酶I 通过向3端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链 DNA polymerase I 裂口，53DNA聚合酶活性与35及53外切酶活； 反转录酶 以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链； reverse transcriptase DNA末端转移酶 将同聚物尾巴加到了

3、线性双链 或单链DNA分子的3OH 末端或DNA的3末端标dNTP,常用的工具酶 工 具 酶 名 称 主 要 功 能 碱性磷酸酶 去除DNA,RNA,dNTP的5磷酸基团； BAP or CIP 核酸外切酶III 降解DNA3OH末端的核苷酸残基； exonuclease III 降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5磷酸的单核苷酸或 nuclease S1 寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子； Taq DNA 聚合酶 能在高温（72）下的单链DNA为模板， Taq DNA polymerase 从53 方向合成新生的互补链 核糖核酸酶 专一性降解RNA； RNase 脱氧核糖核酸酶

4、内切核酸酶，水解单链或双链DNA； DNase,第一节 限制性核酸内切酶,一、限制性核酸内切酶的分类及命名方法 二、限制性核酸内切酶的基本特征 三、影响限制性内切酶的活性因素,限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 主要从原核生物中分离纯化出来。,（一） 限制性核酸内切酶的分类,分为三种类型: I型酶 ：多亚基的蛋白复合物。有识别位点，在距寄主特异性位点至少1000bp处随机切割，切割长短不一而无特异性。 II型酶 ：通常由一种多肽以同源二聚体形式存在。识别位点为旋转对称结构，切割后形成粘性或平末端。 III型酶 ：两个亚基的

5、蛋白复合物，从距识别位点一侧约25bp处切割DNA分子。,限制性内切酶的命名原则,由分离出酶的微生物的属名第一个字母和种名的前两个字母组成，如Eco(从Esherichia coli大肠杆中分离出的酶）； 微生物的菌株或型写在其后右下角BamH； 若寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则表示为HindI、II、III； 所有限制性内切酶均用一个总名称 endonuclese R,其后再加上述已说明的名称； 如:endonuclese R.HindIII。 代表株系和型的字母写在下方不便于打字而在同一水平上书写，如EcoRI. 命名酶名称不再特别注出限制酶和修饰酶，即略去R与M字母,（二）限制性

6、内切核酸酶的基本特征,1、由宿主控制的限制与修饰作用 2、限制内切核酸酶的识别序列特点 3、II型限制性内切酶的切割方式 4、识别序列与切割方式的相关性 5、限制性内切酶的次级活性：星号活性 6、限制内切核酸酶活性的检测方法,1、由宿主控制的限制与修饰作用,由修饰甲基转移酶和限制性核酸内切酶两种酶活性配合进行的 5 -GAATTC-3 3 -CTTAAG-5 EcoRI MEcoRI 限制作用 修饰作用 Me -G3 5AATTC-3 5-GAA TTC-5 -CTTAA5 3G-5 3-CTT AAG-3 Me,+,图 EcoRI与MEcoRI的限制与修饰作用机理,EcoRI,2、限制核酸内

7、切酶的识别序列特点,均有严格的识别特定核苷酸的序列； 识别的核苷酸序列一般在48个碱基对； 大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式；,如EcoRI： -GAATTC- 识别特定连续的核苷酸的序列 -CTTAAG- 产生粘性末端； 如Nla IV： -GGNNCC- 产生平末端 -CCNNGG- 其中N代表一种核苷酸碱基； 如EcoRI 5-NGAATTCN-3 3-NCTTAAGN-5 对称轴,3、II型限制性内切酶的切割方式,三种切割方式：按切割位点相对于对称轴的位置来区分 在对称轴5侧切割产生5粘端 5-NGAATTCN-3 EcoRI 5-NG AATTGN-3 3-NCTTAAG

8、N-5 3-NCTTAA CN-5 5粘端 在对称轴的3侧切割产生3粘端 5-NCTGCAGN-3 PstI 5-NCTGCA GN-3 3-NGACGTCN-5 3-NG ACGTCN-5 3粘端 在对称轴处切割，就产生平末端 5-NCCC GGGN-3 SmaI 5-NCCC GGGN-3 3-NGGG CCCN-5 3-NGGG CCCN-5 平末端,+,+,+,同尾酶 (Isocaudomers),有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同 的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。但两种同尾酶切割形成的DNA片 段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。

9、,MunI：,5 - C A A T T G - 3 3 - G T T A A C - 5,EcoRI：,5 - G A A T T C - 3 3 - C T T A A G - 5,5 - C A A T T G - 3 3 - G T T A A C - 5,5 - G A A T T C - 3 3 - C T T A A G - 5,重新连接后的序列：,5 - C A A T T C - 3 3 - G T T A A G - 5,4、识别序列与切割方式的相关性,（1）识别顺序不同，切割方式不同，产生的酶切片段的末端不同。如前述 （2）识别顺序不同，但酶切后产生同样的两种粘性末端。

10、如BamHI.BglII.Sam3AL -A GATCT- -G GATCC- - GATC- -TCTAG A- -CCTAG G- -CTAG - BglII BamHI San3AL -A 连接酶 GATCC- 连接酶 - -TCTAG G- -CTAG -AGATCC- 连接后的产物由于碱基排列顺序略有变化， BamHI和BglII不能再 -TCTAGG- 识别和切割，而San3AL仍然有可能可以切割。,（3）识别的顺序相同，切割方式不同，如SmalI与XmalI它们的识别顺序为CCCGGG，由于割方式不同，SmalI切割的产物是平末端，而 XmalI的是粘性末端 。 -CCC GGG

11、- SmalI -C CCGGG- XmalI -GGG CCC- 产物为平端 -GGGCC C- 产物为5粘端 （4）相同的识别顺序，相同的切割方式，但对切割位点上对甲基化碱基的敏感性不同，如HpaII和Mspl都在同一位点切割，但HpaII只能切割 -CCGG- 而MspI可以切割甲基化的 -CC Me GG- -GGCC- -GG CC-,5、限制性内切酶的次级活性-星号活性,定义：某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性内切酶 在酶切同一种DNA片段时会产生新的酶切位点而得 到不同的酶解片段的酶活性则称星号活性。 实例：正常：识别 GAATTC 6个核苷酸顺序。 EcoRI 异常：可识别

12、AATT 4个核苷酸的顺序。 酶切产物能电脉鉴定出现的 DNA条带数比 正常情况下有增加。,产生星号活性的因素,(1) 甘油浓度过高：在限制性内切酶的浓度与DNA数量的比值为50u/ugDNA时，甘油的含量为7.5（v/v）便能引起星号活性。当应用酶浓度较低微10u/ugDNA时，甘油含量高于15（v/v）或以上也会引起星号反应。 (2) 离子强度不适合： (3) 阳性离子的变化： 如将反冲体系中Mg# 改为 Mn# 时可促使 EcoRI、HindIII产生星号反应。 (4) 溶液中pH的变化：如用EcoRI 酶解时，反应体系中的pH值 由 PH2.5升高到PH8.5时也会出现星号反应。 (5

13、) 有机溶剂残留的影响：,6、限制内切核酸酶活性检测方法,检测方法：酶的活性的检测通过比较酶降解DNA片段的 程度精确的进行定量。限制性内切酶的活性高低 通常以活性单位表示。 酶单位的定义：现在常见的限制性内切酶的活性单位是1微克的纯 DNA(一般用DNA为基质)在指定的缓冲体系中，指定温度酶解 60分钟完全时酶切所需限制性内切酶的活力量定义为一个酶单位。,（三） 影响限制性内切酶活性的因素,（1）DNA基质的纯度、分子结构的影响； （2）限制性核酸内切酶反应使用的缓冲液的影响； （3）反应体积对酶的影响； （4）反应温度与保温时间对酶活性的影响； （5）酶反应的终止；,（1）DNA的纯度和分

14、子结构的影响,DNA纯度：限制性核酸内切酶酶解DNA的效率很大程度上取决于 DNA本身的纯度。 补救： 适当增加限制性核酸内切酶的量，每微克DNA基质由 1单位提高到510倍。 适当扩大反应体积，以让污染物相应得到稀释。 适当延长酶解的反应时间。 如RNA过多可在反应体系中加入适量的RNase. 分子结构：超螺旋的DNA，其完全酶解所需要的酶量要比已经 酶切成线性DNA的高。有的酶切割同一DNA的不同位点，其效率也有差别。,甲基化酶（dam和dcm）的影响,dam： 催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化 dcm ：催化CCA/TGG序列中内部胞嘧啶残基甲基化， 其他限制性内切酶： 如BglI：

15、对dam甲基化酶发生甲基化作用的DNA很敏感， 对即使纯度再高的这种DNA也很难用什么办法 酶切完全。,（2）缓冲液的质量对酶切的影响,主要组分：其主要组分有MgCl2、NaCl、KCl、TrisHCl、 硫基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）,牛血清白蛋白（BSA）或者明胶等。 三种缓冲液：根据酶的特性制备成相应的缓冲液，通常情况下多采用低、中、高盐三种缓冲液。 浓液冻存：标准缓冲液一般配成10倍浓度，冰冻状态贮存。 防污染：缓冲液中应避免重金属离子及各种核酸酶污染，过滤除菌 牛血清白蛋白在防止酶的分解和非特异性吸附及减轻某些酶变性起一定作用。（注意：由于BSA会与DNA结合,在电脉时会出现条带模糊

16、的拖尾现象。在电脉前可加入适量的SDS，并655分钟后点样，可以消除BSA的影响。 ）,（3）反应体积对酶活性的影响, 反应体系中甘油浓度过高会影响酶切效果，甘油的含量超过5会抑制酶的活性。一般加酶的体积应小于总体积的1/10。 当酶切反应体积小于10ml时，由于酶有一定的粘度，难以做到精确取酶，往往造成酶量不足或过量。因此最好将高浓度的酶溶液进行适当稀释。另外由于小体积的酶切反应会造成水份的蒸发至盖上，造成反应体系内各成份浓度发生变化而影响酶切效果。,（4）反应温度与保温时间对酶活性的影响,反应温度: 不同的限制性内切酶具有不同的最适酶切反应 温度，大多数的酶反应温度为37(少数如 SamI

17、是25、ApaI、 ApyI是30，MaeI是45， BclI50,MeaIII55,BstEII 60,TaqI 65等; 保温时间：A(分解DNA的微克数)B(酶单位) C(保温时间),（5）酶反应的终止,终止酶反应的方法有： 65保温10分钟：（只对此温度敏感的酶有效， 如EcoRI） 加入终止反应液： 终止反应液多为电脉上样液， 主要成份为50甘油，100MM EDTA(PH=8.0), 1SDS和0.1溴酚兰。 用饱和酚、氯仿抽提DNA方法纯化。,第二节 DNA连接酶与DNA的体外连接,一、DNA连接酶 二、DNA片段的体外连接 三、影响连接反应的因素,1、概念及条件： 连接酶：能催

18、化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。 条件：一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基，另一条DNA链的5末端具有一个磷酸基团； 连接酶能封闭双螺旋DNA骨架上的缺口，不能封闭裂口 连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。,一、DNA连接酶,2、两种DNA 连接酶比较 T4 DNA ligase E .coli DNA ligase 来源 T4 噬菌体 大肠杆菌 分子量 60，000 75000 辅助因子 ATP NAD+ 底物 1. 双链DNA分子的粘、平端 同源互补粘端 2. RNADNA杂和体，RNA链缺口 3. 双链DNA分子

19、中的单链缺口 双链分子中的单链缺口 应用范围 广泛 . 效率高 窄,3、DNA连接酶连接作用的分子机理,1) 连接酶与辅助因子ATP（或NAD+） 提供的激活AMP形成一 共价结合的 酶AMP复合物（腺苷酰酶）。同 时释放出焦磷酸（Ppi） 2) 激活的AMP从赖氨酸残基转移到 DNA一条链的5末端磷酸基团 上形成DNA腺苷酸复合物。 3) 3OH末端对活跃的磷原子作亲核 攻击，形成磷酸二酯键， 将缺口封 起来，同时释放出AMP。,二、DNA片断的体外连接,粘端非定向连接 粘端定向连接 平端连接 优点：效率高 效率高 可连接任何平端 定向插入 可恢复产生新酶切位点 有效限制自身环化 缺点：自身

20、环化多 同左 双向插入 同左 多拷贝插入 同左 连接效率低 连接条件： 温度 1216 1620 1216 酶 低浓度 高浓度 低浓度 ATP 高浓度 低浓度 高浓度,连接方式,1、匹配粘性末端连接,定向连接和非定向连接,（1）自身环化： 载体去磷酸化（CIP.BAP) （2）多拷贝插入： A、控制插入片段和载体片段的摩尔数 B、载体片段浓度减小（2050ng) C、连接体积小于10ul （3）连接效率低： A、连接体系内加入低浓度的PEG B、提高DNA的浓度 C、加入T4 DNAligase D、延长连接时间,克服缺点的方法,图：碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止DNA分子环化,2、不匹配的粘端连

21、接, 修平：用SI酶切除双链DNA分子的突出的核苷酸， 将突 出粘端修平，再用T4连接酶作平末端连接。 补平：用Klenow酶将粘端部分补平。使产生平末端或匹 配粘端，再用T4连接酶进行连接。 例如：HindIII与XbaI酶切产生的粘端有两个匹配，两个 不匹配，用Klenon填掉两个不匹配的核苷酸，就产生了 相同的粘端，这种连接方法可以克服DNA片段的 自身连 接，但连接后的重组DNA分子不能被HindIII和XbaI酶切,酶切粘端的补平和连接,HindIII XbaI 5-A CTAGA-3 3-TTCGA T-5 dATP dTTP Klenow dGTP dCTP Klenow 5-A

22、AG CTAGA-3 3-TTCGA TCT-5 T4 DNA ligase 5-AAGCTAGA-3 3-TTCGATCT-5 图：HindIII、XbaI 酶切粘端的补平和连接,（1）同聚物加尾连接,同聚物加尾连接法：这个方法的基本原理是利用末端脱 氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能来实现在DNA 的末端加尾。 优点：这种方法对多种外源基因都能克隆，如：酶解 的、机械切割的、CDNA等。 缺点：克隆片段不能回切插入片段。,3、平末端连接,图：应用互补的同聚物加尾法连接DNA片段,（2）衔接头连接法,衔接头(linker)：是指用化学方法合成的一段1012个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识

23、别位点的平末端的双链寡核苷酸短片断。 优点： 外源基因定向插入， 克服了载体的自连， 重组子插入片段可切回， 连接效率高。 缺点：若目的片断内部有与所加衔接物相同的限制位，在消化衔接物产生粘性末端时，会将目的片断切断。,图 用衔接物分子连接平末端的DNA片断,图 双衔接物连接法的基本程序,（3）DNA接头连接法,DNA接头（adapter）：是由化学合成的一端具有某种限制酶 的粘性末端而另一端为平末端的双链寡聚核苷酸短片段。,(a),(b),图：BamHI接头的连接机理,三、影响连接反应的因素,1反应时间与温度：连接酶最适的反应温度应是37，但在这 一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接反

24、应常采用 的最佳温度一般在416，通常多选用1216 30分钟到 16小时。 2连接酶的用量：粘性末端DNA连接的酶用量在0.1单位时就可 以达到最佳的连接效果，而平端DNA连接所需酶的至少需要 提高1020倍。 3DNA底物的浓度：一般情况下对于连接200500bp的外源 DNA，连接体积在0.10.3ug/10ul，插入片段：载体分子的 摩尔比为 3：1为较好。 4其他干扰因素：EDTA，杂蛋白质，存留有活性的酶等影响 酶切的因素也影响连接。,第三节 DNA聚合酶,种类：大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I 的Klenow大片断酶、T4DNA聚合酶、T7DNA 聚合酶、TaqDNA

25、聚合酶及反转录酶等。 作用：在DNA模板链上将脱氧核苷酸连续地加到双链 DNA分子引物链的3OH末端，催化核苷酸聚 合成以模板互补的DNA序列。 特点：具有催化核苷酸聚合能力，但在外切酶活性， 聚合速率等方面就各有差别。,1、大肠杆菌DNA聚合酶I,证实：1957年由美国生化学家A.kormberg首次证实。 为单链多肽蛋白质，分子量为109103 dal。 它有大小2种亚基组成。 3种酶活性: 大亚基有53聚合酶活性； 有35外切酶活性； 小亚基只有53外切酶活性。,53聚合酶活性,模板：聚合反应要有单链DNA做模板； 引物：带有3OH的引物； 原料：四种脱氧核苷5三磷酸（dATP ，dGT

26、P， dCTP， dTTP）和Mg+等； 聚合：在酶的催化下，DNA的聚合作用是从引物 的5 向3OH方向延伸。 图解： 5 3 3 5 DNA聚合酶I dNTP ， Mg+ 5 3 3 5,35外切酶活性,外切活性: 在一定条件下，聚合酶I也具有外切酶活性的 作用特点: 从游离3OH端切割双链或单链 DNA为单核苷酸，识别和消除不配对的核苷酸，每次只能去除一个单核苷酸， 从而保证了DNA复制的忠实性。 图 解： 5-CCGATCTOH 3 3-GGC-P pol I , Mg+ 5-CCG-OH 3-GGC-P + dAMP+ dCMP + dTMP,53外切酶活性,DNA聚合酶I中的小亚基

27、带有5外切酶活性，它使双链DNA的 5端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸。 5-CCGATCT-3 pol I 5- ATCT-3 3-GGCTAGA-5 Mg+ 3-GGCTAGA-5 +dGMP +dCMP 用途：通过DNA的缺口转移，制备带放射性标记的DNA探针。,2、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow 酶）,Klenow酶：是DNA聚合酶I 经枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶分解切除小亚基而得，又称Klenow酶或Klenow大片段酶。 功能：具有53聚合酶的活性和35核酸外切酶的性，但失去了 全酶的53的核酸外切酶的活性。 用途： （1）用同位素标记酶切DNA片段的末端 如 Bam H

28、I切割的DNA末端可用32PdGTP 5-G 32PdGTP 5-GG+ 3-CCTAG Klenow 3-CCTAG,(2) 补平5粘末端为平端，补平反应原理同上，只是不用 同位素的dNTP，用一般的dNTP。也可用35外切 酶活性除去3末端的单链，生成平端。 （3）合成cDNA的第二条链，由于该酶没有53的外切活 性，因此5端的DNA不会被降解，能合成全长cDNA。 （4）用Sanger双脱氧法则定DNA序列; （5）用于定点突变;,3、Taq DNA聚合酶,分 离：最初由H.A.ErlicH从热泉中的细菌中出来; 酶活性：具有53聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性 耐热性：此酶是一

29、种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，最适反应温 度为7280. 应用性：能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA为模板，在加 入四种dNTP的体系中，以分别结合在两端扩增区为起点 从53的方向合成新生的互补链DNA，因此核酶主要用 途是进行DNA的PCR反应。,4、T4 DNA聚合酶,T4 DNA聚合酶：该酶是从T4噬菌体感染的大肠杆菌分离纯化来的， 由噬菌体基因43编码。 酶活性：它与Klenow酶一样，具有53的聚合酶活性与35外 切酶活性。 特点：与Klenow酶活性相比有如下几个特点： 外切酶活性对单链比对双链更强，比Klenow强200倍。 不从单链模板置换寡核苷酸引物，定点诱变第

30、二条链的合成 效率高于Klenow。 Klenow可用于随机引物标记，而T4 DNA 聚合酶可用替代合 成法标记探针。,5、T7DNA聚合酶及测序酶,超水平表达：T7 DNA聚合酶是从T7噬菌体感染的大肠杆菌宿主细胞中分离纯化获得，现在这两种亚基的编码基因构建的工程菌都实现了在大肠杆菌细胞内的超水平表达。 酶活性高：T7 DNA聚合酶与Klenow一样，但比Klenow的35外切酶活性高1000倍，合成能力最强。 特性；此酶的用途与T4 DNA聚合酶相似，但特别适合于大分子量模板上引物开始的DNA延伸合成。较其他 聚合酶更不受DNA 的二级结构的影响。 修饰酶：测序酶是经化学方法修饰的T7 D

31、NA聚合酶，由于它完 全失去了核酸外切酶的活性，修饰后的聚合酶在加工能力，聚合作用的速率增加了三倍。这些持续合成能力强，加工性能高等特性对于长片段的DNA序列分析是一种理想的工具酶。,6、Amv反转录酶,分离：最初是从鸟类骨髓细胞白血病病毒分离。现在许多种RNA 肿瘤病毒都能分离。 组成：又称依赖于RNA的DNA聚合酶分子量为1.6105Dal,、两 种亚基组成，其中具有53聚合作用的反转录酶活性和 RNaseH活性，后者是一种RNA的外切酶，以53或35方 向特异性地降解RNADNA杂交分子中的RNA链。肽具有以 RNADNA杂交分子为底物的53DNA外切酶活性。 用途: 1）可以mRNA为模板合成单链cDNA； 2）还可利用单链DNA或RNA作模板合成分子探针。,第四节 DNA及RNA的修饰酶,1、末端转移酶：此酶是从小牛胸腺中分离纯化到。 特点： 合成方向53 合成时不要模板，但底物至少要3个核苷酸， 对dNTP非特异性，任一种都可以作提前物 可催化3OH末端单链或3OH突出的双链， 需要Mg+或Mn+， 用Co+代替Mg+作辅助因子，可在平末端 DNA分子上进行末端转录。