细胞培养必备知识.ppt

1、1,细胞培养技术,Tissue culture,2,细胞培养 cell culture 是从体内取出组织的单个细胞或单一细胞群模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并保持细胞特性，为细胞培养。,3,各种液体要专人配制，并保证做到按规程行事；制备浓度精确、灭菌可靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。,组织培养是一种程序比较复杂、需求条件多而严格的实验性工作。由于工作环节多，为保证操作上的一致性，避免造成人为的差异，应将所有操作程序制定统一规范，在一定时间内保持相对稳定和人人遵守。,实验室管理制度,4,培养用品要有固定的存放地点（

2、培养用品与非培养用品存放分开；已消毒与未消毒品严格分开存放）， 目的：避免各种杂质混入细胞生存环境、防止微生物感染和细胞“污染”。,5,二、细胞生存条件及代谢,6,无污染环境 培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。 细胞被置于体外培养后，失去了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物积累等，可导致细胞死亡。,（一）基本条件,7,适宜温度 人体细胞的适宜温度为36.5+0.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。 培养细胞对低温的耐受力比对高温强。 温度不低于0时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用； 对培养液中加一定量的保护剂（甘油或二甲基亚砜），封入安

3、瓿中，冻存于液氮中，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续增殖生长，细胞生物性状不受任何影响，成为保存细胞最主要的手段。,温度对细胞生长的影响,8,气体和pH值 O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。多数细胞缺氧不能生存。 开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般要把细胞置于95%的空气加5%CO2混合气体环境中。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，主要作用在于能维持培养基的pH值。大多数细胞要求7.2-7.4。,CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-,9,营养物质 糖、无机盐 氨基酸、维生素 促细胞生长因子 牛血清是提供生长因子和细胞所需物质的来源

4、 渗透压 离子强度：260-320 mOsm/Kg 人工培养基,10,二、实验设备,无菌间、超净台、洗刷间、储存室、实验工作室 孵箱、CO2孵箱、显微镜、纯水器、液氮罐、抽滤装置、离心机、干烤箱、高压灭菌器、加样器 培养器皿、耗材（试管、吸管）,11,三、在肿瘤学中的应用,12,肿瘤细胞生物特性学研究 比较肿瘤细胞与正常细胞在体外培养条件下生长行为的差异，研究肿瘤细胞生物学特性的改变，对于建立诊断标准有益。 肿瘤细胞体外生长形态学研究 肿瘤细胞生长特性 细胞接触抑制实验,13,肿瘤发病机制研究 肿瘤产生诱发因素的研究 肿瘤细胞侵润机制和过程的研究 肿瘤与正常细胞 共同培养法 研究肿瘤药物筛选,

5、14,异种移植研究 裸鼠发现与应用 建立了动物移植瘤模型 抗肿瘤药物筛选 研究肿瘤细胞调亡以及肿瘤细胞体外分化又成为新热点,15,生物治疗 活细胞-体细胞-体内 活化细胞（LAK）-患者 组织-悬液-培养-回输机体,16,细胞培养：,一、原代培养 二、传代培养,17,一 原代培养,18,原代培养（primary culture） 从体内取出组织或细胞的第一次培养,19,原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA乙二胺四乙酸）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。,20,仪器、材料及试剂 仪

6、器：培养箱（调整至37），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒,21,初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗23次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3060分钟。4. 剪切：用眼科剪把组织切成23毫米大小的块，以便于消化。加入比组

7、织块总量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。,22,5. 消化：或用恒温水浴，或置于37温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（5001000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求

8、在7.27.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。8. 培养：置于36.5温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。,23,初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布2030块。3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿令组织小块流动，塞好瓶塞，置3

9、6.5温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。,24,二. 传 代 培 养,传代培养（passage culture） 将细胞从一个培养器皿中转移或移植到另一个培养器皿中。,25,原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经

10、过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。,26,材料和试剂 1. 细胞：贴壁细胞株 2. 试剂：0.25胰酶、1640培养基（含10小牛血清） 3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等,27,二. 传 代 培 养,准备及注意事项 换 液 传 代 冻 存 复 苏 MTT,28,换液,把细胞培养瓶从培养箱中拿出, 拧紧盖子; 观察瓶内培养基的颜色, 是否浑浊等; 放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。 放入超净工作台内,点燃酒精灯,拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上,至少三秒. 取下盖子,烧瓶口;倒掉培养基,烧瓶口; 拿出PBS液瓶子,烧瓶口和镊子;用镊子将塞

11、子取出,烧瓶口（至少10圈）。,29,准备事项,紫外灯照射细胞室30分钟,风机运行10分钟后方可进入实验室. 穿专用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等. 带手套,并用酒精擦拭之. 准备好实验必需用品. 超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面. 超净工作台内操作完成后， 要用酒精棉球擦拭台面,除了酒精灯,镊子,试管架等物品外,其他都要拿出工作台外. 紫外灯照射30分钟.,30,6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培瓶口， 来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此操作一次。 7.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出， 烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取5ml-8ml的培养基打入培

12、养瓶内，烧瓶口， 镊子和盖子； 9.盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期， 酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。 注意： 1.打开培养箱时尽量不要说话； 2.步骤9中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。,31,传代,1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞 子取出，烧瓶口（至少10圈）。,32,6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培

13、养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。 7.拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取 出，烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子； 9.拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟 后取出；,33,10.在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若 细胞变成单个圆形，则可进行传代。 11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。 12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 13.用吸管吸取5ml的培养基

14、打入培养瓶内， 用吸管吹打成单个细胞悬液。计数，分装 即可。,34,冻存,1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。,35,6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此操作一次。 7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 8. 用吸管

15、吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养瓶口和盖子，盖上盖子； 9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟后取出； 10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞变成单个圆形，则可进行传代。,36,11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。 12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。 14.用吸管将细胞悬液移至5ml离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，1500转/分钟，时间为15 分钟。 15.离心结束后

16、，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子，烧管口。,37,16.弃上清液，加冻存液2ml 吹打，使细胞均匀混在冻存液中，再加3ml冻存液，用吸管吸出打入多个冻存管中，每管1.5ml。 17.盖上盖子，用封口膜封好,标上细胞名称和日期 . 18.冻存方式：430分钟，-2015分钟，-8060分钟，最后转移到液氮罐内。 注意： 冻存管移动时要夹在冰块中间。,38,复苏,1. 取一敞口瓶，内装蒸馏水，放入电热恒温水槽中，温度设置为39.0。 2. 等达到39.030分钟后，用镊子将欲复苏的细胞从液氮管中取出，快速放入敞口瓶内，晃动，使冻存管内完全液化。 3. 用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。 4.

17、用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口； 5. 用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已装有5ml新鲜培养基的培养瓶内。,39,6. 烧瓶口，镊子和盖子；盖上盖子， 在倒置显微镜下观察。 7. 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内. 注意： 步骤2中，蒸馏水不要没过冻存管口 所有步骤结束过24小时后一定要换液；,40,MTT法,1.实验开始前，96孔板应在超净台紫外灯下照射2个小时以上。 2.从培养箱中拿出培养瓶，观察，加PBS，加胰酶消化，加培养基，计数。 （方法及步骤同传代1-13步。） 3.加培养基，调整细胞浓度为10000个/200l. 4.加到96孔板内,每板6行8列共48孔,每孔200l. 5.

18、盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下观察，标明名称，序号和日期。,41,6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。 7. 从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 用200l的枪将孔内的培养基吸出； 8. 加入不同浓度的药物的无血清培养基,每孔200l。 9. 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下 观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24 小时。 10.从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 每孔加MTT液20l。,42,11.盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下 观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养4小时。 12.取出96孔板，倒掉孔内的液体，每孔加

19、 DMSO150l，放入酶标仪内，振荡600秒，读数即可。,43,实验用品的洗涤,橡胶，塑料用品 玻璃器皿,44,橡胶，塑料用品,用自来水冲洗后放入专用烧杯内,加入蒸馏水，使之淹没物品稍许，放在电炉上加热； 等水开时开始记时，三十分钟后取下，倒掉烧杯内的水，自来水冲洗3遍，蒸馏水冲洗2遍，放烤箱下层中烘干； 烘干后浸泡在盐酸中，至少30分钟； 将盐酸倒掉，用自来水冲洗十遍，蒸馏水冲洗三遍，放入烤箱上层烘干 烘干后放入饭盒内高压，之后放烤箱上层再次烘干即可使用,45,玻璃器皿,用自来水冲洗三遍，用蒸馏水洗三遍，放入烤箱下层烘干， 放入清洗缸即酸缸内，让整个器皿没入清洗液中 ,时间为过夜或者至少8

20、个小时以上. 取出器皿，用自来水冲洗十遍，再用蒸馏水冲洗三遍后，放入烤箱上层烘干 。 取出器皿，高压后，放烤箱上层，再次烘干即可使用。,46,污染的处理及预防,按现代的观念，凡是混入培养环境中对细胞生存产生有害的成分和造成细胞不纯的异物都应该视为污染。根据这一概念，组织培养污染物应包括生物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质（影响细胞生存、非细胞所需的化学成分）、细胞（非同种的其他细胞）。其中微生物最为多见。另外，随着使用细胞种类增多，不同细胞交叉污染，尤其是Hela细胞的污染也时有发生，从而造成细胞不纯。,47,一、污染途径,污染物，特别是微生物常通过下列途径进入培养体系，造成污染 1 空

21、气：空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩，以免因讲话、咳嗽等使外界污染进入操作面，造成污染。,48,2 器材：各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染，另外需要对培养箱进行定期消毒，防止形成污染 3 操作：实验操作无菌观念不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造成污染。培养两种细胞以上时，操作不规范，交叉使用吸管或培养液、瓶等有可能导致细胞交叉污染。 4 血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成

22、了污染。 5 组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细胞细胞生长。,49,二、污染对培养细胞的影响及污染的检测,由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复、但是当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分类象减少，细胞变得粗糙，轮廓增强细胞浆出现颗粒、污染较严重，细胞增值停止，分裂象消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆、脱壁。,50,（一）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检

23、测 常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒置显微镜观察不易判断。怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养。,51,如果培养无真的细菌污染，24小时内可以获得阳性结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时，大约每20分钟一代，会使培养系统中很快产生大量细菌，后者不仅可以消耗培养系统中的养分，还能释放大量代谢产物。几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。细菌污染大多数可以改变培养液pH，使培

24、养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。,52,（二）真菌污染对细胞的影响及污染物的检测 微生物污染中以真菌最多，真菌种类繁多，形态各异，但是污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。,53,（三）支原体污染对细胞影响

25、及污染物的检测 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题,是细胞培养最常见的、干扰试验结果的一种污染。但由于不易被察觉，有些污染的细胞仍在被应用。研究表明，95以上是以下四种：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii），为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。据查，目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%的细胞受到支原体污染。,54,污染来

26、源包括工作环境污染、操作者本身污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。,55,细胞培养中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染： 控制环境污染； 严格实验操作； 细胞培养基和器材要保证无菌； 在细胞培养基中加入适量的抗生素。,56,支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗

27、血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。,57,（四）细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测 细胞培养中，细胞间交叉污染并不罕见，多是由于在培养中操作时各种细胞同时进行，混杂使用器皿和液体所致，这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化

28、，有些变化较轻、不易察觉，有些可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制，最终死亡。常用观察细胞形态学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞,58,三、污染的预防:防止污染，预防是关键，预防措施应该贯穿整个细胞培养的始终。,1.器皿准备中的预防：用于细胞培养的器皿应该严格消毒，做到真正洁净；应该无菌的物品，要做到消毒严格、真正无菌；器皿的运输、贮存过程中，要严格操作，谨防污染。,59,2.开始操作前的预防：应当按厂家规定，定期清洗或更换超净台的空气滤网，请专职人员定期检查超净台的空气净化标准；检查培养皿是否有消毒标志，有条件得实验室可以使用一次性

29、用品；检查新配置的培养液，确认无菌方可使用；操作前提前半小时启动超净台的紫外灯消毒；操作应戴口罩，消毒双手。,60,3.操作过程中的预防；主要包括：超净台内放置的所有培养瓶瓶口不能与风向相逆，不允许用手触及器皿的无菌部分，如瓶口和瓶塞内侧；在安装吸管冒、开启或封闭瓶口操作时要经过酒精灯烧灼，并在火焰附件工作；吸取培养液、细胞悬液等液体时，应专管专用，防止污染扩大或造成培养物的交叉污染；使用培养液前，不易较早开启瓶口；开瓶后的培养瓶应保持斜位，避免直立；不再使用的培养液应立即封口；培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中；操作时不要交谈、咳嗽，以防唾沫和呼出气流引发污染；操作完毕后应将工作台面整

30、理好，并消毒擦拭工作面，关闭超净台。,61,4.其他预防：及早冻存培养物；重要的细胞株传代工作应有两个人独立进行；购入的未灭活血清应采取56度水浴灭活30分钟使血清的补体和支原体灭活；为了避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统的抗生素，或尽可能不用抗生素；对新购入的细胞株应加强观察，防止外来的污染源；定期消毒培养箱。,62,四、污染的排除,培养的细胞一旦污染应及时处理，防止污染其他细胞。通常选高压灭菌被污染的细胞，然后弃掉。如果有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常。常用的排除微生物污染的方法有以下几种：,63,1 抗生素排除法：抗生素是细胞培养中杀灭细菌

31、的主要手段。各种抗生素性质不同，对微生物作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后应用好；如果发生微生物污染后再使用抗生素，常难以根除。有的抗生素对细菌仅有抑制作用，无杀灭效应。反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性，而且对细胞本身也有一定影响，因此有人主张尽量不用抗生素处理，当然，一些有价值的细胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在这种情况下，可采用510倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用2448小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效。,64,2 加温除菌：根据支原体耐热性能差的特点。有人将受支原体污染的细胞置于41度中作用510小时（最长可以达18小时）杀灭支原体。但是41度对

32、细胞本身应有较大影响，故在处理前，应先进行预试验，确定最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。 3 动物体内接种：受微生物污染的肿瘤细胞可以接种到同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭掉微生物，肿瘤细胞却能在体内生长，待一定时间，从体内取出再进行培养繁殖。,65,4 与巨噬细胞共培养：在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活710天，并可以分泌一些细胞因子支持其他细胞的科隆生长。与体内情况相似，巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。利用96孔板将极少培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度地同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染地效能。本方法与

33、抗生素联合应用效果更佳。,66,无菌操作注意事项 1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5. 瓶子开口后要尽量保持45斜位。 6. 吸溶液的吸管等不能混用。,67,End！,68,69,70,71,72,溶液的配制,PBS RPMI1640培养基 消化液 冻存液 清洁液 MTT 其它溶液,73,PBS配制,之后，加1000ml三蒸水,调节PH值在 7