种子扩大培养

1、种 子 扩 大 培 养,1、在空气过滤除菌的过程中空气储罐的作用是 ，丝网除沫器的作用是 。空气加热设备的作用 是 。 2、空气过滤器按过滤介质空隙大小分为 和 。 3、介质孔隙大于被拦截的微生物大小，但介质层有一定的厚度，机理是静电、扩散、惯性及拦截作用。 4、在实验室或中试规模，空气过滤器只设 级，而大型发酵工厂大多采用 级过滤。 5、工厂发酵生产中棉花活性炭过滤器一般用作 ，金属烧结管和微孔膜过滤器一般用作 。,缓冲空气脉冲,除去 较小液滴,降低空气的湿度,绝对过滤,深层过滤,一,二,总过滤器,分过滤器,1、连续提供一定流量的压缩空气。VVM一般为0.12.0 m3 。 2、空气的压强(

2、表压)为0.20.4 MPa。 3、进入过滤器之前，空气的相对湿度70。 4、进入发酵罐的空气温度可比培养温度高1030。 5、压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器时，一般取失败概率为10-3为指标。,发酵用无菌空气的基本要求,1、湿热灭菌的条件是 。 2、发酵培养基灭菌中， 方法对灭菌的蒸汽压力要求高。在分批灭菌过程中要先 通过 进行预热，在通入蒸汽升温到121。 3、连消的特点是 和 ，适合 发酵罐。,夹套或蛇管,121 30min,连续灭菌,快速,高温,大型,对数穿透定律：,对数残留定律,对数生长定律,比热死速率,过滤常数,比生长速率,发酵工程的流程,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化

3、,扩大培养,种子罐,发酵罐,培养基制备灭菌,灭菌,产物分离纯化,成品,原料预处理,种 子 扩 大 培 养,现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。,一、概述,1、定义：菌种的扩大培养就是把保藏在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或摇瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。,2、作为生产用种子的准则,1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短。,2）生理性

4、状稳定,3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求,4）无杂菌污染,5）保持稳定的生产能力,实验室种子制备阶段 （一级种子培养）,生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵,砂土孢子,冷冻干燥孢子,斜面孢子,摇瓶液体培养,茄子瓶斜面培养,固体培养基培养,一级种子罐,二级种子罐,发酵罐,二、种子制备工艺,生产菌种的制备 两个过程：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程和在液体培养基上生产大量菌丝的种子制备过程 孢子的产生条件？,孢子制备 放线菌孢子的制备 工艺过程,注意事项 限制碳源(约1%)和氮源(不超过0.5%)； 培养温度多为28 ，少数为37 ，培养时间

5、为514天； 采用孢子进罐：工艺简单，批间差异小，便于控制孢子质量；采用菌丝进罐：可缩短种子罐内的培养时间(尤适生长缓慢的菌种)。,霉菌孢子的制备 注意事项 天然农产品因具有独特的营养成分 和较大表面积而适合作霉菌的培养基 培养温度多为2528 ，培养时间为414天,细菌孢子的制备 注意事项 1.适合采用碳源限量而氮源丰富的培养基 2.培养温度多为37 ，少数为28 ，培养时 间细菌菌体为12天，产芽孢的细菌为510天,种子制备 概念：指将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基种培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。 摇瓶种子 种子罐种子,摇瓶种子制备 孢子发芽或菌丝繁殖缓慢的菌种需将

6、孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，摇瓶具有浓缩种子罐的作用，其培养基配方和培养条件与种子罐相似。 种子培养基营养应丰富完全，易被菌体利用，浓度不宜过高。,种子罐种子制备 A. 孢子或摇瓶菌丝被接入体积较小的种子罐中，培养后形成的大量菌丝，这种种子称为一级种子 把一级种子转入发酵罐中发酵，称为二极发酵 种子罐的级数主要决定于菌种的性质、菌体的生长速度和发酵设备的合理应用 种子罐级数减少，有利于生产过程的简化和发酵过程的控制，减少因种子生长异常而造成的发酵波动,实验室种子制备阶段： 琼脂斜面 固体培养基扩大培养 摇瓶液体培养,生产车间种子制备阶段： 种子罐扩大培养,对接种物的一般要求：,1）应以

7、高产菌株中分离获得的纯系作为出发菌株。菌株纯度高，性状稳定，不易发生变异。 2）生理活性强。 若以菌体细胞为接种物，应采取正在旺盛生长的繁殖期细胞，菌体细胞应均匀，同步率高。以孢子为接种物，应采用易于萌发的孢子。,为了提高孢子的萌发率，有时需采取一些特殊措施 如： 丙酮丁醇梭菌的孢子在沸水中处理90秒后在放入液体培养基底部，可获得较高的发芽率。 有的孢子不被水浸润，浮在液体培养基表面或贴在培养容器内壁，不形成悬液。可在培养基中加入少量无毒的表面活性剂，帮助形成悬液。,1、实验室种子制备,对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子；这样操

8、作简便，不易污染杂菌。 如：柠檬酸生产的制种，用麸皮培养基产生大量孢子直接用于种子罐接种。,对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 如：用灰色链霉菌生产链霉素 用卡那链霉菌生产卡那霉素,对于不产孢子的细菌，生产上一般采用将试管斜面菌种接入茄瓶斜面或摇瓶培养。 如：谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸,实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等。如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，

9、获得相同的培养条件。,2、生产车间种子制备,2）种子罐的作用： 主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。,种子罐,2）种子罐级数的确定,种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。,一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度以及所采用发酵罐的容积而定。,细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27C,40小时孢子发芽，产生菌丝 ）二级种子罐（ 27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 酵母：比细菌慢

10、，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子,种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会； 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会；,确定种子罐级数需注意的问题,对于生长快的细菌，种子用量比例小，故种子罐相应也少。 如： 谷氨酸生产中，采用茄瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于32培养710h，菌体浓度达108109个/ml，即可接入发酵罐作为种子。 这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。,生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，其孢子悬浮液接入一级种子罐扩大培养于27培养40h，此时孢子发芽，长出短菌丝，再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐，于27培养1024h，菌丝迅速繁殖，

11、获粗壮菌体，即可移至发酵罐作为种子。 这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。 一般50m3发酵罐都采用三级发酵,生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养（四级发酵）,在小型罐（5500L）中进行实验时，通常采用直接将孢子或菌丝体接入罐中发酵，这可称为一级发酵。,种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来的染菌的机会。,但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。,虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但也与所选用工艺条件有关。 如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的

12、繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。,种子罐1 发酵罐1 发酵罐2 种子罐2,移种方式：,1）单种 2）双种 3）倒种 4）混种,1）单种：一个种子罐接种到一个发酵罐中。 2）双种：为加大接种量，两个种子罐接种到一个发酵罐中。 3）倒种：种子罐染菌又无备用种子时或种子质量不理想可采样倒种法，以适宜的发酵罐倒出部分给另一发酵罐。 4）混种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。,2）种龄,种龄种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。,选择适当种龄的菌种接种十分重要,通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。,过于年轻的种子接入

13、发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，造成异常发酵的情况。,过老的种子会引起生产能力下降，菌体过早自溶。,不同品种或同一品种的工艺条件不同，其菌龄也不一样，一般要经过多次试验，考察其发酵罐中产量的多少来确定最适种龄。,嗜碱性芽孢杆菌种龄对产酶 （碱性蛋白酶）的影响,3）接种量,接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。,大多数抗生素发酵的最适接种量为715%，有时可增加到20 25%；而由棒状杆菌生产谷氨酸 接种量只需1%。,除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的各阶段接种量一般均需0.510%的接种量。,接种量的大小取决于生产菌种在发酵中生长繁殖

14、的速度。,采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来。,近年来，不少厂家以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施；有的产品采用两个种子罐接一个发酵罐的双种法。 如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8%，且达到产量高峰的时间提前。,但如果接种量过大，往往使菌体生长过快、培养液黏度增加，造成溶氧不足，从而影响产物的合成。 如由嗜碱芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的发酵，1%接种量产酶活最高，在0.54%之间虽有差别，但影响不大；如超过4%则酶产量明显下降。,3、种子质量的判断,为了保证各级种子移种前的质量，除了保证规定的培养条件外，在过程中还要定期取样测定一些

15、参数以观察基质的代谢变化及菌体形态是否正常。,1、细胞或菌体 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。,2、生化指标 通常测定的参数有：,1）pH 2）培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量变化 3）菌体形态、菌体浓度和培养液外观（色素、颗粒等） 4）其它参数，如某种酶的活力,如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系，可通过测定种子液中淀粉酶的活力判断种子质量。,细菌菌体浓度的测量方法有 。 霉菌浓度的测量方法有 。 霉菌或放线菌孢子测量的方法

16、有 。,OD600,测干重,血球板计数,稀释平板计数,测干重,离心测体积,血球板计数,稀释平板计数,细菌培养温度多为 ， 发酵。霉菌培养温度多为 ， 发酵，放线菌培养温度多为 。 发酵。酵母 发酵 A.25-28 B. 28 C. 37 A.二级 B.三级 C.四级 二级发酵,二级,二级,二级,二级,37,25-28,28,3、产物生成量 在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。,4、酶活力 种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。,种子异常分析,菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团 菌丝粘壁,影响孢子质量 的

17、因素 及控制,培养基,培养条件,培养时间 和 冷藏时间,三、影响种子质量的因素,1、培养基,生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。,原材料质量的波动，起主要作用的是其中的无机离子含量不同。如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。,1、培养基,生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。,如： 四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量均有一定影响。 制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。 蛋白胨加工原料

18、不同（如鱼胨或骨胨）对孢子影响也不同。 水质的硬度、污染程度对生产均有影响,水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。,措施 培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用 严格控制灭菌后培养基的质量 斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间 供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源,2、培养条件,1）温度,2）湿度,不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的影响 相对湿度 斜面外观 活孢子数（108/支） 16.5

19、19 上部稀薄，下部稠，略黄 1.2 2536 上部薄，中部均匀，发白 2.3 4045 一片白，孢子丰富，稍皱 5.7,3）通气量,一般需保证充足的通气,温度对多数品种斜面孢子 质量有显著影响。 如 ：土霉素生产种子，在高于37培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等。,制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大影响。,3、培养时间和冷藏时间,（1）培养时间 一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。 措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量

20、正常的阶段终止培养。,（2）斜面冷藏时间,斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。 如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4C冰箱保存，发现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。 冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。 如在链霉素生产中，斜面孢子在6冷藏2个月后的发酵单位比冷藏1个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。,4、接种量,接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。,影响种子质量 的因素及控制,接种量,种龄,孢子的质量,培养基,培养条件,四、种子质量的控制措施,1、培养基 营养成分适合种子培养的需要； 选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基

21、； 营养上要易于被菌体直接吸收和利用； 营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高。 营养成分要尽可能与发酵培养基相近。,2、培养条件 （1）温度 （2）通气量: 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。 例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。 但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。,3、种龄 种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。

22、时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。,不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。 嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。,4、接种量 接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。,但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。 通常接种量，细菌15%，酵

23、母菌510%，霉菌715%、有时2025%。,种子质量的控制措施,种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。 首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。 菌种稳定性的检查 无（杂菌）检查,五、生产发酵罐的无菌接种技术,生产规模发酵罐的接种，包括两个方面： 从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐； 从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。,压差法 接种瓶 压力差 火焰封口法 在种子罐接种口周围设有沟槽，沟槽内注入少量酒精，点燃酒精使接种口被围在一圈火焰之中；在火焰圈中即可将菌悬液倒入种子罐中。,从种子罐到发酵罐的接种，是通过接种

24、管道，在压力作用下进行的。,从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种,从种子罐接种,第二节 实例,一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养 斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵罐 1、斜面菌种的培养 菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。 (1) 斜面培养基组成 葡萄糖 0.1 蛋白陈 1.0 牛肉膏 1.0 氯化钠 0.5 琼脂 2.02.5 PH 7.0 7.2 （传代和保藏斜面不加葡萄糖） (2) 培养条件：3334，培养1824h。,2、 一级种子培养 一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。 (1) 培养基组成 葡萄糖 2.5 尿素 0.5 硫酸镁 0.04 磷酸氢二钾 0.1 玉米浆 2.53.5(按质增减) 硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppm PH 70,(2) 培养条件 用1000mL三角瓶装入培养基200mI，灭菌后置于冲程7.6cm、频率96次min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温度3334 (3) 一级种子质量要求 种龄：12h pH值：6.4 0.1 光密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5以下 无菌检查：(-) 噬菌体检查：