(讲课)基因工程的基本操作程序

1、基因工程的基本操作程序,1、目的基因的选择获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤:,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,一、目的基因的选择获取:,1、目的基因:,主要是编码蛋白质的结构基因; 也可以是具有调控作用的因子。,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,从基因文库中获取。,利用PCR技术扩增； 化学方法直接

2、合成。,人工合成：,从已有的物种中分离：,把需要研究的基因称为目的基因。,基因工程所述的目的基因：,（一）、从基因文库中直接获取：,1.什么是基因文库？ 将某一物种的生物不同的基因许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存起来，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，由这些含有不同基因片段的受体菌群组成的基因总和称为基因文库。,2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类,种类,基因组DNA文库：含有一个物种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一个物种生物的部分基因， 如：cDNA文库,3.如何构建基因文库或构建基因文库遵循原则：,简单的说：就是根据目的基因的有关信息进行分类。 如根据基因的核苷

3、酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、以及基因翻译产物等特性来构建基因文库。,4. 构建基因文库 的方法：,直接分离法(鸟枪法)：,反转录法：,提取某种生物的全部DNA,用适当的 限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,.直接分离法(鸟枪法),某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,反转录法：cDNA的合成流程图解,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较：,5.如何从基因文库中寻找目的基因：,简单的说：根据建立基因文库时的

4、分类索引来寻找。 如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、以及基因翻译产物等特性来构建基因文库。,原核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区上游,编码区下游,不能编码蛋白质 可调控遗传信息的表达 (调控序列),原核细胞的基因结构,与RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶是由多个肽链 构成的蛋白质，能识别并与 调控序列中的结合位点结合, 催化转录形成RNA。,与RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶,RNA聚合酶,RNA聚合酶,真核细胞的基因结构,一个典型的真核细胞基因结构示意图,编码区含有： 能够编码蛋白质的序列(外显子) 不能编码蛋白质的插入序列

5、(内含子),真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区下游,调控遗传信息的表达 (调控序列),外显子 (能编码蛋白质),内含子 (不能编码蛋白质),转 录,前体RNA,mRNA,一个典型的真核细胞基因结构示意图,原核细胞基因与真核细胞基因的比较,都是由能够编码蛋白质的编码区和 具有调控作用的非编码区组成。,编码区是连续的,编码区是间隔的， 是不连续的,1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的（ ） A、染色体DNA B、线粒体DNA C、总mRNA D、tRNA,2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的 描述正确的是（ ） A、某生物的全套基因就是一个基因文库； B、

6、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库； C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库； D、含有一个生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库。,A,C,（二）利用PCR技术扩增目的基因：,是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。,PCR聚合酶链式反应:,PCR技术:,PCR扩增仪,DNA双链复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子.,原 理：,前 提：,原 料:,过 程：,高温变性（解旋为单链）,低温退火（引物与单链互补结合）,适温

7、延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链）,重复循环,预变性（增加DNA变性的概率）,PCR技术具体过程：,a、高温DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、低温退火复性（55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、适温延伸（70-75）：在耐热DNA聚合酶（Taq）的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA。,双链,DNA链,在生物体内双链DNA解链能采用高温吗？,PCR(多聚酶链式反应）,结 果：,方 式:,以_ 方式扩增， 即_（n为扩增循环的次数）,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,PCR技

8、术扩增与DNA复制的比较：,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,例、多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95下使模板DNA变性、解链55下复性（引物与DNA模板链结合）72下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是：（ ）,A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现； B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成；

9、 C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸； DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高。,答案；C,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA (即目的基因),反转录,合成,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,（3）、化学合成方法 ：,二、基因表达载体的构建 基因工程的核心,1、构建基因表达载体的目的：,使目的基因在受体细胞中

10、稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2、操作环境：体外操作,3、基因表达载体的组成：,目的基因； 启动子； 终止子； 标记基因。,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,运载体与基因表达载体等同吗？：,1、不同点： “运载体”泛指基因工程操作中能将外源基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。“运载体” 强调它的运载基因功能，只

11、要能运载基因就算是运载体。 “基因表达载体”，是指能够运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。它强调的不仅是运输，更重要的是运输后能够使目的基因表达。 基因表达载体的构成： 目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因。,2、相同点： “基因表达载体”是在”运载体”的基础上构建成的； 运载体与基因表达载体都含有复制原点及外源基因 。,运载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在运载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯

12、键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。 复制原点与启动子：复制原点是DNA复制的固定起始点， 启动子是位于结构基因 上游 的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA 相结合并具有转录起始的特异性。 简单的说：一个是DNA复制开始，一个是转录开始。,注 意：,例、 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子（抗虫基因首端），导人棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有

13、抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子（抗虫基因末端），导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。由以上过程推知，基因表达载体应具备的结构是 （ ）,A、目的基因、启动子 B、目的基因、终止子 C、目的基因、启动子、终止子 D、目的基因、启动子、终止子、标记基因,答案:D,例、为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。,据图回答： 图中基因组文库 （填“小于”、“等于”或“大于”）cDNA文库。,B过程需要的酶是 ；,目的基因和除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中 和 为模板直接进行PCR扩增，该

14、过程中所用酶的显著特点是 。,逆转录酶,DND,cDNA,耐高温,三、将目的基因导入受体细胞转化：,（一）转化概念：,（二）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,农杆菌特点及转化原理：,农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的一段特殊的T-DNA（可转

15、移的DNA）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,（1）农杆菌转化法：,过 程,基因枪转化法 ：它的主要原理是将含目的基因的载体包被（吸附）在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化。,（

16、2）基因枪法：,（3）花粉管通道法：,花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化.,2、将目的基因导入动物细胞：,提纯含目的 基因表达载体,从母体取卵（受精卵）,通过显微注射仪注 射 基因表达载体,对含目的基因的受精 卵进行早期体外培养,移植母体动物 输卵管或子宫内,方 法：显微注射法,程 序：,发育具有 新性状动物,原核生物特点：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子。,方 法：,3、将目的基因导入微生物细胞吸附转化,繁殖快、单细胞、遗传物质少。,条件：,缓

17、冲液：Mg 2+、ATP辅助因子、 DTT（二硫苏糖醇）、血清蛋白。,温度：12160c 12-16小时； 或780c 23天。,受体细胞能用结核杆菌吗？,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因：,（1）方法:,DNA分子杂交,DNA分子杂交：来源不同的两条单链核酸分子,通过碱基互补形成异源双螺旋分子的过程。,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,（2）过 程:,A、首先取出转基因生物的基因组DNA； B、取含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,该段DNA称作基因探针； C、使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。,

18、基因探针：指带有放射性标记，能与目的基因互补的已知核苷酸序列的一段单链DNA或RNA。 基因探针的条件： 单链DNA或RNA； 有易被检测的标记； 高度特异性。 基因探针种类： 基因DNA探针； cDNA探针； RNA探针。,归纳步骤,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,方法:,分 子 杂 交,过 程: 用DNA探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了m

19、RNA。,分子杂交,用被标记的 目的基因探针,从转基因生物 中提取mRNA,显示杂交带转录成功,未显示杂交带转录失败,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质：,方法:,抗原抗体杂交,过程：,目的 基因,大肠杆菌蛋白质动物体内抗体（）,转基因生物蛋白质 （抗原）,免疫,注入,表达,表达,是否特异性结合,大肠杆菌 实验动物,转基因生物,分别导入,归纳步骤,（二）、鉴定（个体生物学水平）,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定

20、、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”

21、或“b”）,a,a,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。 （3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和 。 （4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪法（花粉管通道法）,植物组织培养,脱分化和再分化,耐盐基因,一定浓度盐水浇灌,例、2009年10月，我国自主研发的转基因抗虫水稻“华恢1

22、号”获得农业部颁发的安全证书。下图表示该抗虫水稻主要培育流程，据图回答： （1）过程应用的主要生物技术是 。,2）组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（部分基因及部分限制性内切酶作用位点），据图分析： 人工改造时，要使抗虫基因表达，还应插入,人工改造时用限制酶处理，其目的是：第一，去除质粒上的 基因，保证TDNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于 。第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等。,若用限制酶分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒。分别以含四环素和卡那霉素的培

23、养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的现象是在含 能够生长，而在含 中能生长。,答案：（1）植物组织培养 （2）启动子tet和tmr目的基因（或外源DNA）准确插入卡那霉素的培养基四环素的培养基 解析：（1）过程表示植物细胞组织培养成植物体。（2）基因表达载体应含有启动子、终止子、目的基因、标记基因。从图看出限制酶能破坏tet和tmr。由图看出限制酶已将四环素抗性基因破坏。,1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练 习：,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练 习：,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练 习 ：,4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C