微生物检验基本技术.ppt

1、杨爱华,微生物检验基本技术,一 微生物实验的准备,璃器皿的洗刷与准备 （一）洁净剂及使用范围 最常用的洁净剂是肥皂，肥皂液（特制商品），洗衣粉，去污粉，洗液，有机溶剂等。 肥皂，肥皂液，洗衣粉，去污粉，用于可以用刷子直接刷洗的仪器，如烧杯，三角瓶，试剂瓶等； 洗液多用于不便用于刷子洗刷的仪器，如滴定管，移液管，容量瓶，蒸馏器等特殊形状的仪器，也用于洗涤长久不用的杯皿器具 和刷子刷不下的结垢。 有机溶剂是针对污物属 于某种类型的油腻性，而借助有机溶剂能溶解油脂的作用洗除之，或借助某些有机溶剂能与水混合而又发挥快的特殊性，冲洗一下带水的仪器将水洗去。如，甲苯，二甲苯，汽油等可以洗油垢，酒精，乙醚，

2、丙酮可以冲洗刚洗净而带水的仪器。,(二）洗涤液的制备及使用注意事项,1.强酸氧化剂洗液 强酸氧化剂洗液是用重铬酸甲（K2Cr2O7）和浓硫酸（H2SO4)配成。K2Cr2O7在酸性溶液中，有很强的氧化能力， 对玻璃仪器又及少有侵蚀作用。所以这种洗液在实验室内使用最广泛。 配制方法大致相同：取一定量的K2Cr2O7（工业品即可），先用约12倍的水加热溶解，稍冷后，将工业品浓H2SO4所需体积数徐徐加入K2Cr2O7不溶液中（千万不能将水或溶液加入H2SO4中），边倒边用玻璃棒搅拌，并注意不要溅出，混合均匀，俟冷却后，装入洗液瓶备用。新配制的洗液为红褐色，氧化能力很强。当洗液用久后变为黑绿色，即说

3、明洗液无氧化洗涤力。例如,配制12%的洗液500mL。取60克工业品K2Cr2O7置于100mL水中（加水量不是固定不变的，以能溶解为度），加热溶解，冷却，徐徐加入浓H2SO4 340mL，边加边搅拌，冷后装瓶备用。,.碱性洗液 碱性洗液用于洗涤有油污物的仪器，用此洗液是采用长时间（小时以上）浸泡法，或者浸煮法。从碱洗液中捞取仪器时，要戴乳胶手套，以免烧伤皮肤。 常用的碱洗液有：碳酸钠液（Na2CO3,即纯碱），碳酸氢钠（Na2HCO3,小苏打），磷酸钠（Na3PO4,磷酸三钠）液，磷酸氢二钠（Na2HPO4)液等。 . 碱性高锰酸钾洗液 用碱性高锰酸钾作洗液，作用缓慢，适合用于洗涤有油污的器

4、皿。配法：取高锰酸钾（KMnO4)4克加少量水溶解后，再加入氢氧化钠（NaOH)mL。,（三）洗涤玻璃仪器的步骤与要求,.常法洗涤仪器 洗刷仪器时，应首先将手用肥皂洗净，免得手上的油污附在仪器上，增加洗刷的困难。如仪器长久存放附有尘灰，先用清水冲去，再按要求选用洁净剂洗刷或洗涤。如用去污粉，将刷子蘸上少量去污粉，将仪器内外全刷一遍，再边用水冲边刷洗至肉眼看不见有去污粉时，用自来水洗36次，再用蒸馏水冲三次以上。一个细干净的玻璃仪器，应该以挂不住水珠为度。如仍能挂住水珠，仍然需要重新洗涤。用蒸馏水冲洗时，要用顺壁冲洗方法并充分震荡，经蒸馏水冲洗后的仪器，用指示剂检查应为中性。具体操作如下： （l

5、）新购的玻璃器皿的洗涤 将器皿放入盐酸溶液中浸泡数小时，以除去游离的碱性物质，最后用流水冲净。 对容量较大的器皿，如大烧瓶、量筒等，洗净后注入浓盐酸少许，转动容器使其内部,表面均沾有盐酸，数分钟后倾去盐酸，再以流水冲净，倒置于洗涤架上晾干，即可使用。 （2）常用旧玻璃器皿的洗涤 确实无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用前后，可按常规用洗衣粉水进行刷洗； 吸取过化学试剂的吸管，先浸泡于清水中，待到一定数量后再集中进行清洗。 （3）带菌玻璃器皿的洗涤 凡实验室用过的菌种以及带有活菌的各种玻璃器皿，必须经过高温灭菌或消毒后才能进行刷洗：,A、 带菌培养皿、试管、三角瓶等物品，做完实验后放入消毒桶内，

6、用0.1MPa灭菌2030 min后再刷洗。含菌培养皿的灭菌，底盖要分开放入不同的桶中，再进行高压灭菌。 B、带菌的吸管、滴管，使用后不得放在桌子上，立即分别放入盛有35%来苏尔或5%石炭酸或0.25%新洁尔灭溶液的玻璃缸（筒）内消毒24h后，再经0.1MPa灭菌20 min后，取出冲洗。 C、带菌载玻片及盖玻片，使用后不得放在桌子上，立即分别放入盛有35%来苏尔或5%石炭酸或0.25%新洁尔灭溶液的玻璃缸（筒）内消毒24h后，用夹子取出经清水冲干净。 如用于细菌染色的载玻片，要放入50g/ L肥皂水中煮沸10min，然后用肥皂水洗，再用清水洗干净。 最后将载玻片浸入95%酒精中片刻，取出用软

7、布擦干，或晾干，保存备用。 若用皂液不能洗净的器皿，可用洗液浸泡适当时间后再用清水洗净。,五）器皿的包扎：,要灭菌后的器皿仍保持无菌状态，需在灭菌前进行包扎。 （1）培养皿：洗净的培养皿烘干后每10套（或根据需要而定）叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，或装入特制的铁桶中，然后进行灭菌。 （2）吸管：洗净、烘干后的吸管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。塞入的棉花量要适宜，多余的棉花可用酒精灯火焰烧掉。每支吸管用一条宽约45cm的纸条，以3050的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量，若干支吸管包扎成一束进行灭菌。使用时，从吸管中间拧断

8、纸条，抽出试管。,五）器皿的包扎：,（3）试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/3塞进管口。 目前，国内已开始采用塑料试管塞，可根据所用的试管的规格和试验要求来选择和采用合适的塑料试管塞。 若干支试管用绳扎在一起，在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸，再用绳扎紧。三角瓶加棉塞后单个用油纸包扎。,接种、分离纯化和培养技术,一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 、接种工具

9、和方法,接种、分离纯化和培养技术,接种和分离工具 1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： 划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。,接种、分离纯化和培养技术,）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺

10、接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ）浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ）涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。,接种、分离纯化和培养技术,）液体接种 从固体培养基中将菌洗下

11、，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。 ）注射接种 该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。 ）活体接种 活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可,接种、分离纯化和培养技术,、无菌操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）

12、于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。,接种、分离纯化和培养技术,图5斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞 二、分离纯化,含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。,接种、分离纯化和培养技术,、倾注平板法 首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔

13、化好的保持在40-50左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。,1.菌悬液 2.熔化的培养基 3.培养物 4.无菌水 、涂布平板法 首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。 具体操作：面包酵母菌，古巴酵母菌，假丝酵母菌 将菌液分离样品摇匀，将0.1ml菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置。右手拿无菌三角玻扒在平板

14、培养基表面上,将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直来回推动,平板内边缘处可改变方向用三角玻扒再涂布几次。,、平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图5）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。（图5）,1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,具体操作： 将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙（约30）伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30-40，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖