细胞化学染色及临床评价.ppt

1、临床血液及检验,细胞化学染色,一、教学目的： 根据血细胞化学染色的结果诊断血液疾病 二、教学要求 1. 掌握:过氧化物酶染色、铁染色的原理、操作及临床意义 2. 熟悉:非特异性酯酶染色、碱性磷酸酶染色、过碘酸-雪夫反应的原理、意义及临床应用 3.了解:酸性磷酸酶染色的原理及意义,三、教学内容 1.常用血细胞化学染色（铁染色、过氧化物酶染色、碱性磷酸酶染色、醋酸萘酚酯染色、过碘酸-雪夫反应） 2.结合血细胞化学染色鉴别急性白血病类型 3.结合血细胞化学染色鉴别贫血类型,细胞化学染色，是一种以形态为基础，结合运用化学或生物化学技术对血细胞内各种化学成分作定位、定性及半定量分析的方法。 用于研究血细

2、胞生理、病理和化学结构； 临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后监测和发病机制的探讨，提供重要依据。,血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构，反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性。 血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。,（一）固定 固定有物理法与化学法， 物理法为干燥和火焰固定， 化学法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。,血细胞化学染色流程,（二）显示 1、偶氮偶联法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。 2、联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新

3、生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。,3、普鲁士蓝法： 细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。 4、雪夫反应： 过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。 5、金属沉着法: 其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。,（三）细胞化学定量 粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。 百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。 积分法，是常用的半定量法，将等级估量与百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低，又反映了细胞受色的强弱。

4、,下面介绍几种常用的细胞化学染色方法,这些方法学在白血病的鉴别诊断上具有重要意义。,一、过氧化物酶染色（POX）,（一）四甲基联苯胺法 【原理】 粒细胞和单核细胞的胞浆内的髓过氧化物酶（POX or MPO）分解过氧化氢，释放新生态氧，使无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺，后者进一步变成棕色化合物沉着于细胞质内。,【结果】 细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。 （） 无颗粒沉着； （） 颗粒细小 ，分布稀疏； （+） 颗粒较粗，局灶分布； （+） 颗粒粗大，分布较密，占胞质 1/22/3； （+） 颗粒粗大，呈团块分布； （+） 全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核。,【临床意义】 （1）粒系： POX主要分布在

5、粒细胞和单核细胞内，随着粒细胞成熟的程度而逐渐增强，中性分叶核粒细胞为强阳性。 嗜酸性粒细胞阳性程度最强，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。 碱性粒细胞为阴性。,（2）单核细胞： 原始单核细胞为阴性反应， 幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应，颗粒细小，弥散分布。,（3）其他细胞 淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细胞、巨核细胞均呈阴性反应。 （4）血小板过氧化物酶 主要定位于幼稚型巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种标志物，有助于FAB M7的识别。,（5）过氧化物酶染色 主要用于鉴别急性白血病类型，急性髓细胞白血病多呈阳性反应，以M3和M2型反应最强，MI和M5型反应较弱，故有助于区

6、别M3和M5型。 急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应，故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标。,AML-M1,M1 - POX(+),二、酯酶染色,【原理】 酯酶是分解各种酯类的水解酶，根据机制的不同,分为非特异性酯酶和特异性酯酶。单核巨噬细胞类为非特异性酯酶反应而染色，中性粒细胞类则为特异性酯酶反应而染色，因此在判别单核细胞类或中性粒细胞类时非常有用，特别是二重染色法非常重耍。,酯酶染色的方法较多，常根据其作用液的pH和底物的不同将常用的酯酶染色法分为两类： 特异性酯酶染色法，如氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色法； 非特异性酯酶（NSE）染色法常用-乙酸萘酚酯酶和-丁酸萘酚酯酶染色法。,（一

7、）特异性酯酶染色法,【原理】 氯乙酸ASD萘酚被细胞内特异性酯酶水解，产生ASD萘酚，再与稳定的重氮盐偶联，生成不溶性红色沉淀，定位于胞浆中。,【结果】 阳性反应为红宝石色颗粒，定位于胞浆中。,【临床意义】 特异性酯酶又称粒细胞酯酶主要分布在粒细胞和肥大细胞内。早幼粒细胞和中幼粒细胞呈强阳性反应，分叶核粒细胞酶活性减弱，原粒细胞为阴性或阳性反应。嗜酸性粒细胞呈阴性，嗜碱性粒细胞、单核细胞和肥大细胞呈阴性或弱阳性反应。红系细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、淋巴细胞呈阴性。,本染色法主要用于鉴别急性白血病类型。急性粒细胞白血病时，原粒细胞和幼稚粒细胞均呈一定程度阳性。成熟粒细胞酶活性下降； 急性单核

8、细胞白血病和急性淋巴细胞白血病时，白血病细胞呈阴性； 急性粒一单核细胞白血病时，部分白血病细胞(原粒和早幼粒细胞)呈阳性，有些白血病细胞(原单核和幼单核细胞)呈阴性。,【质量保证】 染色温度以3839为宜，此时酶反应强而无明显扩散。此酶不受氟化钠抑制，并且萘酚较低温时易溶解。,（二）非特异性酯酶染色,血细胞的非特异性酯酶及其同工酶种类很多，凡能作用于短链脂肪酸，水解醇和酚的羧酸酯的酶就称为非特异性酯酶。现仅介绍a一乙酸萘酚酯酶(-NAE)染色法。,【原理】,a一乙酸萘酚酯酶将乙酸萘酚水解，产生萘酚，再与重氮盐（如坚牢蓝B）偶联，生成不溶性的有色(灰黑或棕黑色)沉淀。,用氟化钠抑制试验作对照，在

9、40 ml作用液中加人氟化钠15mg，其余方法同上。两种方法染色后用油镜计数100或200个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的阳性率和积分。按公式计算出抑制率：,【结果】,细胞浆内有灰黑色或棕黑色弥散性颗粒状沉淀为阳性，胞浆内无沉淀为阴性。,积分标准,“”胞浆无灰黑色或棕色颗粒； “+”浅灰色，极少黑色沉淀； “2+”浆灰黑色片状，占胞浆12； “3+”浆充满灰黑色沉淀或弥散灰黑色； “4+”浆内较深的灰黑色或充满弥散黑颗粒。 “一”记为O分，“+”记为1分，“2+”记为2分，“3+”记3分，“4+”记为4分。,【临床意义】,非特异性酯酶又称单核细胞酯酶，主要存在于单核细胞和组织细胞内。正常

10、单核系细胞各阶段均呈阳性，且该反应可被氟化钠抑制。该酶在粒细胞和淋巴细胞内含量较少，通常呈弱阳性反应(不被氟化钠抑制)或阴性。巨核细胞和血小板为阳性反应。,-乙酸萘酚酯酶染色对三种急性白血病类型的鉴别有重要意义，急性单核细胞白血病(M5型)、急性粒-单核细胞白血病(M4型)的单核系细胞与少数急性粒细胞白血病(主要是M3型)的早幼粒细胞，呈阳性反应但前者可被氟化钠抑制(抑制率在50以上)，而急性粒细胞白血病的早幼粒细胞不被氟化钠抑制或仅部分轻度抑制。急性淋巴细胞白血病一般为阴性。,【质量保证】,1.标本必须新鲜，应于取材后2天内染色。 2.重氮盐可选择，以坚牢蓝B、坚牢蓝RR及坚牢黑B重氮盐为好

11、。 3.染色时间和温度应恒定。,三、过碘酸一雪夫（PAS)染色,【原理】 胞浆内存在糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（periodic acid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫(Schiff )试剂中的无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于胞浆中。该反应称为过碘酸一雪夫(PAS)阳性反应。,【结果】 （1）粒细胞系： 原粒细胞多呈阴性反应，也可弱阳性。自早幼粒细胞以后随着细胞的成熟程度，阳性反应逐渐增强。嗜酸粒细胞颗粒本身不着色，但颗粒间的胞质呈弥漫性阳性反应； 嗜碱粒细胞为阳性反应，颗粒紫红色，大小不一。,中性粒细胞糖

12、原含量参考标准 （-） 胞质无颗粒 （+） 胞质呈淡红色，无颗粒 （+） 胞质呈红色，有少量颗粒 （+） 胞质呈暗红色 ，颗粒较密 （+） 胞质呈紫红色，颗粒极密,过碘酸-Schiff反应(PAS),（2）淋巴细胞系： 大多数淋巴细胞呈阴 性反应， 少数为（+）的阳性反应。 淋巴细胞糖原含量程度参考标准 （-） 胞质内无颗粒 （+） 胞质内有颗粒 （+） 有较粗红色颗粒 （+） 有粗大红色颗粒 （+） 颗粒粗大并有红色块状,（3）红细胞系： 幼红细胞和红细胞呈阴性反应 红细胞系列糖原含量程度参考标准 （-） 胞质无颗粒 （+） 有少数红色颗粒 （+） 有较粗红色颗粒或弥漫红色 （+） 有粗大红

13、色颗粒或深红色 （+） 有粗大红色块状或紫红色,（4）巨核细胞： 巨核细胞和血小板染色反应均为阳性 巨核细胞糖原含量程度参考标准 （-） 胞质无颗粒 （+） 少量糖原包涵体 （+） 中等量糖原包涵体，定位于核膜 出或分散胞质中，占胞质1/3 （+） 大量糖原包涵体分散于胞质的1/2 （+） 糖原包涵体充满整个胞质,PAS 巨核细胞,巨核细胞包涵体,（5）单核细胞呈阴性或阳性，颗粒细小，往往位于胞质边缘； 浆细胞大多呈阴性，少数为红色颗粒阳性； 组织细胞为阴性反应； 巨噬细胞可呈阳性，为红色颗粒反应。,【临床意义】 （1）M6与巨幼贫的鉴别 M6的幼红细胞PAS可呈强阳性，积分明显增高，巨贫、再

14、障、溶贫时PAS反应为阴性。 （2）急性白血病的类型鉴别 ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性，AML为阴性，急性单核细胞白血病时原单核细胞及幼单核细胞PAS阳性，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。,ALL-L1,L1 PAS(+),AML-M5,M5 PAS(+),AML-M6,AML-M6 PAS(+),AML-M7,M7 PAS(+),（3）巨核细胞和Sternberg细胞鉴别 巨核细胞PAS强阳性，Sternberg细胞为阴性或弱阳性。 （4）戈谢氏细胞强阳性，尼曼-皮克细胞阴性或弱阳性。 （5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖原积分增高；一般的病毒感染，糖原积分在正常范围内。

15、,四、中性粒细胞碱性磷酸酶染色,偶氮偶联法（Kaplow法） 【原理】中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在pH 9.29.8缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出磷酸与萘酚。再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。,【结果】 坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒， 坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。 “一”阴性反应，胞浆中无阳性染色颗粒。 “”胞浆中含有少量颗粒或呈弥散浅红色（或弥散紫色）。 “2”胞浆中含有中等量颗粒或弥散受色。 “3”胞浆中有丰富的颗粒或弥散深色，胞核清晰。 “4”有极丰富的粗大颗粒，充满胞浆，或弥散深色，胞核不清晰。,中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP),偶氮偶联法,NAP积分法 计

16、数100个成熟中性粒细胞，按其反应强度分级，各级百分率与其级数乘积的总和，即为积分。 例如： NAP反应结果（%） （-） （+） （+） （+） （+） 20 40 20 15 5 积分=（020）+（220）+（315）+（45）=145 参考值：正常人血细胞碱性磷酸酶除成熟中性粒细胞（杆状核及分叶核）可见阳性外，其他血细胞均为阴性。 中性粒细胞NAP活性积分值一般为1050分，但有时可高达162分。,【临床意义】 （1）生理变化： 新生儿NAP增高，成人较儿童减低，老人更低；激烈运动增高； 月经期经前增高，行经后降低，经后期恢复正常； 妊娠期2-3月轻度增高，以后逐渐增高，分娩时达到高峰

17、，产后恢复正常。,（2）、病理变化 增高：严重化脓性感染、类白血病反应、AA、CML加速期、ALL、CLL、恶性淋巴瘤、癌转移、MM、真红、骨髓纤维化等。 减低：PNH、CML、恶性组织细胞病、MDS。,（3）疾病鉴别诊断 慢粒与类白的鉴别：CML减低，类白增高。 急性白血病的鉴别：AML减低，ALL增高。 PNH与AA鉴别：PNH减低，AA增高。 病原微生物的鉴别：病毒感染减低，细菌感染增高。,NAP (+),CML-NAP(-),五、骨髓铁染色,【原理】正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中，骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝反应，形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定

18、位于含铁的部位，从而反映骨髓中铁的储存量。 化学反应过程为： 4Fe3+ 3K4Fe（CN）6 Fe4Fe（CN）6312 K+ （含铁物质） （亚铁氰化钾） （亚铁氰化铁）,【结果】 （1）细胞外铁的观察 ： 细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小株状或团块状。 以油镜观察定级标准 （-） 无铁粒可见。 （+） 少数铁粒或铁小珠。 （+） 较多铁粒和铁小珠。 （+） 很多铁粒、铁小珠和少数小块。 （+） 极多铁粒、铁小珠并有很多小块，密集成堆。 正常范围：+，“+”占2/3，“+”占1/3。,细胞外铁,（2）细胞内铁观察： 细胞内铁指有核红细胞胞质内出现蓝色颗粒，以油镜计100个中、晚幼红细胞，记录胞质

19、中含有蓝色小颗粒（即铁粒红细胞）的比值。并根据细胞铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为如下四型：,型：仅含1-2个铁颗粒。 型：含3-4个铁颗粒。 型：含6-9个以上铁颗粒。 型：10个铁颗粒。 正常范围：30% 90% ，平均60%， 多见型，少见型，无、型。,细胞内铁,（3）环形铁粒幼红细胞： 指含铁颗粒6个，其中2/3以上铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整环形。 正常或非铁粒幼细贫血无环形铁粒幼细胞，铁粒幼细贫血中环形铁粒幼细胞6% 。,环形铁粒幼细胞,【临床意义】 1缺铁性贫血时， 骨髓细胞外铁明显减少，为“一”“士”，细胞内铁平均5.9%，仅为I型。 经有

20、效铁剂治疗后，外铁增多。 因此骨髓铁染色是诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法。,2铁粒幼细胞性贫血时， 外铁“2”一“3”，内铁平均70%，其铁粒粗大，以 型为主，出现较多环形铁粒幼细胞。 因此，本实验是诊断铁粒幼细胞贫血的有效方法。 MDS也可出现环形铁粒幼细胞。,3. 非缺铁性贫血 如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度的增加。 但再生障碍性贫血不会出现环形铁粒幼细胞，可作为与MDS鉴别的参考。 4. 继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少，但细胞外铁不减少。,教学提纲： （一）.常用血细胞化学染色 1.铁染色 2.过氧化物酶染色 3.碱性磷酸酶染色 4.醋酸萘酚

21、酯染色 5.过碘酸-雪夫反应 （二）.结合血细胞化学染色鉴别急性白血病类型 （三）.结合血细胞化学染色鉴别贫血类型,五.重点：过氧化物酶染色、铁染色的原理临床意义 难点：结合血细胞化学染色鉴别急性白血病类型 六.学科发展动态： 参考书目:临床血液学及检验第7版，许文荣人民卫生出版社，2007年7月 全国临床检验操作规程第3版，叶应妩，中华人民共和国卫生部医政司，2006年11月 临床血液学细胞学图谱第3版，刘志洁，科学出版社，2006年8月 学习网站：中华检验医学网(),七.思考题： 1.急性白血病患者一般要做哪些细胞化学？ 2.如何用细胞化学鉴定急粒及急淋？ 3.慢粒最常用的细胞化学染色是？ 4.外铁染色的临床应用。 5.为了区别红白血病与巨幼红细胞性贫血，下列首选试验是： A、POX染色 B、PAS染色 C、ALP积分测定 D、a-NAE染色 E、铁染色,6.鉴别慢性粒细胞白血