细胞培养及材料细胞毒性检测.ppt

1、b，1，细胞球培养cell culture，b，2，前言细胞球培养的基本概念细胞球培养的基本方法细胞球培养的污染和检测细胞球冷冻保存和复苏细胞球管理和保存细胞球毒性检测，主要内容是b，3，Wilhelm Roux (1850-1924 )，1885年Roux首次尝试对组织进行体外培养1 .前言b，4，alexiscarrelfrancerockefellerinstituteformedicalresearchnewyork，纽约，usab.1873 d.1944，1912年Harrison和1912年Harrison 他建立的鸡胚胎胚胎成纤维细胞持续3.4年(1912-1946 )，b，5，

2、器官培养(Organ culture ) :取出机体中的整个器官或部分器官，在体外生存、生长，并维持了一定的结构和功能特征。 组织培养(Tissue culture ) :将生物体的小组织(O.51立方毫米)放置在基质上孵化，细胞球从周围出来生长。 细胞球培养(cell culture ) :将提取的组织机械性或消化性地分散在单一的细胞球混悬剂中，培养、增殖。、2、基本概念、肿瘤、胚胎、成体、粗切、消化、切碎、修剪、细胞球培养、组织培养、器官培养、b、6、细胞球培养的优点，生细胞球易于控制检查条件和观察到均匀性，易于人工筛选，b、7，培养细胞球和体内细胞球差异，失去原来的组织架构和形态，单一性

3、别分化得不到不灭性，b，8，体外培养细胞球的生长类型贴壁型：动物的正常细胞悬浮型：血液淋巴细胞，肿瘤细胞球，植物细胞球固定化培养，b，9， 来源：真正的胚胎成纤维细胞心肌、平滑肌、成骨细胞、内皮细胞球形态：体内胚胎成纤维细胞等形态细胞纺锤状或不规则三角形细胞质外露的2.3个长度不同的突起有卵圆形核的胚胎成纤维细胞样细胞球，b，1.0， 成长的特征：放射状排列，螺旋状不与连接片紧密接触，容易切断细胞球细胞球接触的单独行动，b， 1.1、培养细胞球的生长和增殖过程原代细胞：从机体取出后立即培养的细胞球的原代培养：从体内取出的细胞球由培养继代培养：原代培养细胞继续传代培养：体外培养条件下继续传代培养

4、的细胞，b，12，细胞培养的工作原则，无菌无毒， 制备生物相容性良好、环境质量好的细胞球源培养基用高纯度药品和脱络离子水标准化方法培养的液体极其多，负责人应负责，浓度准确，所有配制的溶液瓶中有名称、浓度、消毒的有无和制造日期等所有培养用品应有一定的保管场所，以免杂乱无章其中特别重要的是培养用品和非培养用品应严格区分，消毒品和未消毒品应分别存放，b、13 3.细胞球培养基本条件，无菌条件：洁净演播厅、淋浴室、传导窗、高效过滤器、洁净层流罩、生物保密工作箱、超洁净工作台电干燥箱、过滤器、高压灭菌器、抗生素细胞球生长条件：培养板、培养瓶、CO2孵化机、培养基、血清细胞球检测条件：倒置显微镜、酶催化剂

5、标准器、微板块振荡器、高速离心机移液管细胞的保存条件：液氮浴、超低温冰箱、b、14、常用仪器和设备， 超洁净工作台高压蒸汽灭菌器过滤除菌装置倾倒显微镜水精制装置恒温培养箱电气干燥箱离心分离机、天平、水浴、摇床液氮浴冰箱： 4、-20、-80， b、1.5、细胞球培养仪器移液器移液器移液器培养瓶： 25cm2、75cm2、150cm2培养皿： 3.0、60、120mm多孔培养板： 4、6、24、96孔离心管冻结存储管、b、16、 根据b、1.7、基础培养基8095血清520蓝、链霉素各100Uml、完全培养基组成、b、1.8天然培养基：血清血浆组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)、培养基、合成培养基：

6、细胞球生存所需物质的种类和量，以人造的的方法合成。 含有四种物质：无机盐、氨基酸、维生素和碳水化合物为目前常用的培养基： RPMI-1640、DMEM、M199、MEM，人工合成培养基只能维持细胞球的生存。 为了使细胞球生长繁殖，需要补充一定量的天然培养基(血清等)。b、1.9、常用血清胎牛血清、新生牛血清、犊牛血清、兔血清、马血清等优质血清标准透明，无鹅黄色、沉淀物，无细菌、支原体、细小病毒污染。 血清的失活(补体活性的除去)是由5.6、3.0成分引起的。 血清消毒：过滤除菌、血清使用、b、2.0、其他细胞球培养液，水：新鲜三蒸水或去络离子水平衡盐溶液主要由无机盐和葡萄糖制备：常用于渗透压维

7、持、缓冲和酸盐基度调节的缓冲液：生理盐溶液PBS Hanks液(D-Hanks常用于胰酶催化剂溶液的制备)，b，b 制备的具体操作全部在超洁净台上完成。 青霉素8.0万U/瓶，注射器中加入4ml灭菌水。链霉素为100万U/瓶，加入经过5ml灭菌的双蒸汽洒水，每毫升2.0万u。 使用时溶解于培养液中，蓝色、链霉素浓度最终为100U/ml。 庆大霉素：使用最终浓度为100U/ml，在宽光谱下稳定。 b、2.2、主要作用：水解作用赖氨酸或精氨酸连接的肽键，除去细胞球间粘蛋白和糖蛋白，使壁细胞从瓶壁脱落，分离细胞球。 常用浓度： 0.25%用无Ca2、Mg2的PBS缓冲液或D-Hanks调制，用过滤器

8、过滤除菌。 消化时间：用含有血清的培养液停止细胞的消化作用。 胰蛋白酶溶液、消化液：胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液、b、2.3、b、2.4、贴附生长型细胞球必须贴附在基质上才能生长的细胞球。 在形态上大致分为上皮细胞型和成纤维细胞型，也有很难特定稳定的形态的细胞。 4、细胞球培养的基本方法：黏附、黏附、延展、b、2.5、细胞球；1 )取材切割、组织块培养法、消化培养法；2 )直接购买培养、(原代培养)、传代、体外培养的原代细胞和细胞球株，为了在体外持续培养，必须进行传代。 培养的细胞单层汇合后，密度过大，生存空间不足，营养枯竭，将培养的细胞分散从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转

9、移到其他容器中进行培养，这就是传代培养。弃旧培养液洗净、加入消化液、弃消化液、加入培养液、吹散分散细胞球、继续培养加入稀释细胞球的培养液，b、2.6、接种数为51048105个/ml。 传代密度过低的话，细胞容易死亡，表示细胞生长有很长的停留时间。 培养液因pH下降而呈黄色，为了显示细胞达到了最大密度，需要进行液交换和传代培养。 如果是单层贴壁的细胞球，只要在培养瓶的表面均匀生长，就可以传代。 传代注意事项，b，2.7，游离期浮游，细胞质收缩，所有细胞球均为球形。 在吸附期粘贴基质，一般在24小时内粘贴墙壁。 潜伏期细胞有生长活动，几乎没有增殖。 细胞株的潜伏期通常为624小时。 对数生长的长

10、期细胞数随时间变化倍增，活力最高，最适合实验研究。 在停止期(平台期)细胞生长满瓶壁的话，细胞有活力但不分裂。 反应历程：接触抑制、密度依赖性、细胞球传代增殖过程，b、2.8、细胞球观察、肉眼观察：培养液颜色和透明度显微镜观察生长良好的细胞球：细胞球透明度大、折射性强、轮廓不明显生长状态差的细胞球：细胞球轮廓强、细胞折射性弱的细胞质中有空泡、脂滴、 其他出现颗粒物质的细胞球间空隙增大的细胞球形态不规则，失去原来的细胞球特征，发生蜷缩脱落的细胞表面及周围可能出现线状物，b、2.9、细胞球计数，每1ml细胞球数血球计数板，b、30，细胞生长指标，细胞生长曲线的壁率有丝分裂指数(MI ) :分裂相数

11、在总细胞球数中所占的比例细胞球组倍增时间四唑盐(MTT )比色法是胸腺嘧啶核苷(3H-TdR )的配合量，b、3.1、细胞球活力测定细胞球活力：总细胞球中活性细胞所占的百分比是蓝法四唑盐(MTT )比色法(荧光素二乙酸酯法) 四唑盐(MTT )比色法MTT比色法原理：活细胞球中的琥珀黄素脱氢酶将四唑盐还原成不溶性干燥水的蓝紫色产物甲舍(formazan )，沉淀在细胞球上，死去的细胞球没有此功能。 二甲基亚砜(DMSO )溶解了堆在细胞球上的蓝紫色结晶物，溶液颜色的浓淡与formazan量成正比。 甲舍染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定了a值。、b、3.3、细胞球培养其他指标、细胞球

12、大小：螺旋测微器细胞球重量：称量法新鲜干燥重量，b、3.4、细胞球固定和染色，细胞固定苏木精-伊红染色玛姬msa染色Feulgen染色考马尔布朗染色免疫法细胞核染色： Hoechst、DAPI、b、35，细胞污染混浊、pH异常变化， 异细胞球污染微生物污染：细菌、真菌、支原体、细小病毒，5 .细胞球培养污染和检测，b、3.6、细菌污染，培养液呈黄色，浑浊的镜子下预防和处理正球状粒子漂浮：青霉素、链霉素用3.7、真菌污染培养液一般不白浊的白色和黄色小点悬浮在培养基表面的光镜观察到菌丝的预防和处理：经抗真菌剂、b、3.8、支原体污染、过滤烟嘴无细胞贴壁，细胞球营养液仍亮黄色，细胞球生长缓慢，部分细

13、胞脱落，细胞间隙细小、b、3.9、污染的康特罗尔、再培养的预防鉴别去除：采用抗生素、加温、支原体特异性血清、共培养法、再爱沙尼亚克朗法、动物体内接种除菌法防止交叉污染，b、4.0、6 .细胞球冷冻保存和复苏、缓冻急速溶解低温保护剂：甘油和二甲基亚砜DMSO、细胞球深低温保存的基本原理：-80以下b、4.1、缓慢冻结后融化，细胞球冷却到零度以下时，细胞脱水，细胞球中的可溶性物质浓度升高，在细胞球内形成冰晶这样的变化。 慢慢冷冻的话，细胞会逐渐脱水，细胞内不会形成大的冰晶，与此相反，冰晶较大的冰晶会引起细胞膜、细胞器的损伤及破裂。 复苏过程应尽快融化，目的是小冰晶形成大冰晶，即防止冰晶的再结晶。b

14、、4.2、7 .细胞球的管理和存储，完成的细胞系和细胞球的命名习惯没有严格统一，大多用有一定意义的缩略词和符号来表示。 但是，无论什么形式，为了记忆和理解都不能太长。 HeLa :供体患者的名字(来源于宫颈癌) CHO :中国仓鼠卵巢细胞NIH/3t3 :美国国家卫生研究所成立，3日1 、b、4.3、细胞球面包车的建立、主细胞球面包车生产用细胞球面包车、原始细胞球库、主细胞库、生产细胞库、b、44、细胞保存机制ATCC (americantypeculturecollection ) www.ATCC.orge CCC (europeancollection .uk中科院典型培养物保存委员会细胞球库，45 8.细胞球毒性的测定，参照GB/T16886.5-2003 (或ISO10993-5 )，医疗器械的生物科学评价第5部分：细胞球毒性试验体外法规定的方法进行测定。4.6、样品制备辐射消毒，将检测材料在相应条件下提取(在不含血清的培养基中在3.7环境下2.4时间提取)的细胞球数接种至9.6孔培养板，放置CO2孵化机37，培养24小时后，丢弃原培养液。 空白对照组加入新鲜的细胞球培养液，供试样品加入样品浸出液(加入血清)，放置CO2孵化机继续培养(至少