菌落总数测定

1、食品卫生微生物学检测的菌落总数测定、严纪文、菌落总数测定、菌落概念：菌落(colony )是指细菌在固体培养基上培养后繁殖形成的肉眼可识别的生长物聚集而成的数万个相同的细菌。 菌落总数的定义：对样品进行处理，在一定条件下培养(如培养基成分、培养温度和时间、pH、好氧等)，得到1mL(g )样品中含有的菌落总数。 得到的结果中含有在方法规定的条件下生长的好中温的好氧和兼性厌氧菌。 卫生学意义：菌落总数主要作为判定样品污染程度的指标，应用该方法观察样品中细菌的性质和繁殖动态，也可为对样品进行卫生学综合做评估提供科学依据。 主要修订内容，培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂。 蚁群的计数公式被修正了。

2、加上了关于正在扩展的殖民地的说明。 添加了PetrifilmTM细菌总数检查试验片法。 增加了接触大头针式匀浆机和同等的设备。 第一法平板计数法，培养基变化情况，平板计数琼脂(PCA )胰蛋白酶5.0g酵母精2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mL，营养琼脂(NA ) 蛋白胨10.0g牛肉浆3.0g氯化纳金属钍5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mL样品处理，需加入敲打均质或等效设备，对均质的使用效果和对检测结果的影响有不同报道：每种食品样品均采用不同的均质方法，检测结果不同均质方式对金黄色葡萄球菌和大肠菌群检测的影响也不同。菌落总数检测计程仪图、样品、1.0倍系列稀释、2.3个

3、合适的样品均一液，各装1mL在无菌培养平皿中，各皿上适量培养基(PCA )、菌落数、3.6、482h、报告、样品稀释、固体和半固体样品： 25g样品放入装有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐溶液的无菌均质杯中，装入装有8000r/min10000 r/min均质1min2min或稀释液225 mL的无菌均质袋中，用拍打式匀浆机敲击1min2min，制成1:10的样品均匀液液体样品：用无菌吸管吸取2.5 ml样品，将磷酸盐缓冲稀释液或生理盐溶液混入装有225mL无菌玉米瓶(瓶内定径套适量无菌玻璃珠)中，制成1:10的样品均一液。 用无菌移液器1mL或微量移液器1mL吸引1:10样品的均匀液1m

4、L，慢慢注入沿着管壁放入了9mL稀释液的无菌试管(注意吸管和吸管的前端不要接触稀释液面)，摇晃试管，或者更换1根无菌移液器反复喷涂均匀混合用以上操作制备1.0倍系列稀释样品均一液。 每次分阶段稀释，更换无菌吸管或吸引器各1mL。 根据样品污染情况的估计，选择了2.3个合适稀释度的样品均一液(液体样品可以含有原液)，进行1.0倍增量稀释时，每稀释一次，将1mL样品均一液吸到2个无菌平皿中。 在云同步中各取1mL稀释液，放入2个无菌平皿作为空白对照。 立即将平皿倒在蒸发制冷了15ml的20ml直至4.6的平板计数琼脂培养基(放入461恒温水族箱中保温)中，使平皿旋转均匀混合。 样品在琼脂培养基表面

5、可能含有弥漫性菌落的情况下，在凝固的琼脂表面复盖薄的琼脂培养基(约4mL )。 培养、琼脂凝固后，翻转平板，361培养48h2h。 水产品301培养72h3h。 数蚁群数，可用肉眼观察，必要时用放大镜或蚁群数，记录稀释倍数和相应的蚁群数。 蚁群数以蚁群形成单位(cfu )表示。 菌落数在30cfu300cfu之间，选择没有蔓延的菌落生长的平板，计算菌落总数。 小于3.0 cfu的平板记录的具体的菌落数超过300cfu的记录是不可能的。 每个稀释度的菌落数必须采用两个平板的平均值。在一个平板上生长大的片状菌落的情况下，不应该采用，如果将没有生长片状菌落的平板作为其稀释度的菌落数的片状菌落小于平板

6、的一半，剩下的一半的菌落的分布均匀，则可以在计算平板的一半后乘以2 平板内链状菌落生长时(菌落间无明显界限线时)，各链(不同来源)应作为一个菌落计。 结果表达菌落总数的计算方法是，如果一个稀释度平板上的菌落数在适当的计数范围内，计算两个平板的菌落数的平均值，平均值乘以相应的稀释倍数，作为每g(ml )菌落总数的结果。 当连续稀释度在2个平板菌落数在适当的计数范围内时，用N=C/n1 (0.1 n2) (d )式计算，如果所有稀释度的平板上的菌落数大于300，则计数稀释度最高的平板，其他平板能记录为多少不可，结果为平均菌落数如果所有稀释度的平板上的菌落数小于3.0，则将稀释度最低的平均菌落数乘以

7、稀释倍数进行计算。 如果所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则小于1乘以最低稀释倍数计算。 如果所有稀释度的平均菌落数不在30300之间，并且其一部分大于300或小于3.0，则将最接近的平均菌落数乘以稀释倍数来计算。 蚁群总数报告，蚁群数在100以内时，根据“四舍五入”原则进行修改。 在100以上的情况下，上位3位的数字按照“四舍五入”的原则修正之后，取上位2位的数字，之后，也可以用0表示结果的1.0的指数形式代替位数，这种情况下，按照“四舍五入”的原则也可以采用2位的有效数字。 因为所有平板上扩展的菌落而无法计数的情况下，报告菌落扩展。 空白对照上若有菌落生长，则此次检查结果无效

8、。 称重采样以cfu/g为单位进行报告，体积采样以cfu/mL为单位进行报告。 菌落总数计算公式的变化、统计学依据：平板菌落数越多，取样量越有代表性(不考虑稀释倍数和培养基营养状况等)，取样量越大，结果越有代表性(排除同等取样条件和其他干扰因素) 使用计算式公式的前提：连续稀释度在适当计数范围内(30300个菌落数) N=C/n1 (0.1 n2) (d) N :样品中的菌落数c :平板菌落数之和n1:适当范围菌落数的第一稀释度(低)平板个数n2:适当范围菌落数的第二稀释度2个，计算例：样品稀释：样品稀释时，无菌操作下有代表性的样品25g(25mL )采集225mL灭菌稀释液。 将固体样品裁断

9、，用拍打式样品处理器制作样品混悬剂(1:10 )。 在食品卫生标准和样品污染情况估算的基础上，又进行了1.0倍增稀释。 请注意，每次分阶段稀释时，为了保证样品的稀释倍率的精准性，必须再更换一根吸管。 从吸管内取出灭菌吸管时，请注意不要让吸管的前端接触到手或其他可能接触污垢的部分。 (例如，玻璃瓶口、试管品、容器内残留的吸管的露出部分)。 进行稀释时，请注意采样的精准性。 (例如，吸入液体时，首先要高于吸管的刻度，抬起吸管的前端离开液面，将液体放入到目标刻度。 注入液体时，请沿管壁注入，以免吸管接触稀释液的液面，以免吸管外附着的食品残渣进入稀释液。 平板接种和培养：根据食品卫生标准要求和样品污染

10、情况的估算，选择2.3个稀释度。 放样品时要注意外来的污染。 倒入培养基的温度和厚度是实验是否正确的关键。 (灌注温度：一般3545，温度过高时领便当损伤的菌细胞。 厚度：直径9cm的平皿一般需要1520mL的培养基，如果培养基过薄，培养过程中水分蒸发可能影响细菌的生长。为了防止细菌增殖和产生片状菌落，在加入样品液后，在20min以内注入培养基。 将样品和培养基混合时，首先旋转到单向式，然后向相反方向旋转。 旋转时不要让混合物洒到盘子边缘上。 培养基凝固后，尽快翻转平盘进行培养，使琼脂表面干燥，尽量避免菌落增殖，影响计数。 为了抑制污染，在实验过程中，在桌子上打开琼脂大板块，其暴露时间相当于样

11、本制备、稀释到盛盘的暴露时间，然后与样本一起培养，调查样本在操作中是否受到外部污染。 每个培养温度：的样品细菌都有一定的大姨妈特性，培养时应用不同的营养条件和大姨妈条件可能产生不同的结果，因此必须根据检验标准的要求选择合适的培养温度和培养时间。 食品： 3.6，482 h。 饮用水： 3.6，48h。 水产品： 3.0，723 h。 (3.6培养和3.0培养的结果有很大差异，同样水产品48h的结果和72h也有差异。 对照试验：样品的稀释液中多含有食品颗粒。 在这种情况下，为了不与细菌菌落混淆，可以对照样品，不进行培养，在4个环境中放置，计数时用于对照。 或可以使用TTC营养琼脂作为培养基。 菌

12、落数：如果高稀释度平板上的菌落数大于低稀释度平板上的菌落数，则检测过程中可能出现错误，样品中可能含有抗菌物质，这种结果不能用于结果报告。 平板上出现链状菌落的话，菌落之间之所以没有明确的界限，可能是因为琼脂和标本混合时，一个细菌块分散了。 一条锁链被用作殖民地的计。 培养中遇到昆虫的侵入，昆虫通过的地方就会形成链状的菌落，分别计算的话就是要不得。 平板上菌落过多不能计数时，报告过多不能计数。 在最高稀释度的平板上任意选择2cm2的面积，计算菌落数，除以2求出每个cm2面积的平均菌落数，乘以63.6 (皿底面积cm2数)。 检体为微生物系制剂(酸牛奶、酵母制酸性饮料等)时，在进行菌落计数时，将相

13、关微生物(乳酸菌、酵母菌)排除，报告检体中不含的菌落总数。 进行菌落计数时，样品中的霉菌和酵母菌也不得计数。第二法petriilmtm细菌总数试验片法、petriilmtm细菌总数试验片法、原理：细菌使黄素脱氢酶将相应的基质脱氢酶释放氢络离子，培养基中的TTC作为氢络离子的接纳体，在接受氢络离子后还原为红色不溶性产物即三苯基甲烷，使细菌着色，易观察优点：培养基具有良好生产质量的菌落数量特别方便(易读)，红菌落，食品粒子分离容易，无菌落重叠，核对设计，易计数菌落分布特别均匀，平行平板菌落结果一致性好， 这与培养基避免对细菌造成热损伤有关的菌落扩散和半透明菌膜现象较少的安全方面：像玻璃平盘一样容易损坏，不会对人造成潜在伤害，密封好，不易直接接触。 缺点：有红色颗粒时需要注意的粘稠液体样品，难以分散的表面活性较大，容易流出的泡沫较丰富的样品等颜色特别重，像橘红色一