传染性病原体高敏核酸检测的临床应用价值#专家专业

1、传染性病原体高敏核酸检测的临床应用价值,山西省人民医院 检验科 梁红萍,1,专家资料,当代中国行医之难，医生要如何保护自己？,2,专家资料,贵阳儿童HIV感染事件,2017.10.28-12.7，1岁儿童被苹果卡住眼管，贵阳市妇幼保健院，HIV“阴性”；ICU，纤维支气管镜、气管插管、输血 2017.12.7转院至重庆医科大附属儿童医院，住院前筛查：HIV；父母HIV- 2018.3.15：出院 2018.6.1：贵州医科大学附属医院，HIV+ 2018.6.27：贵阳市第五人民医院，HIV+,3,专家资料,到底“该不该” 筛查传染性疾病标志物？,xxxx医院输血治疗同意书” 中需要填写的内容

2、： HBsAg等HBV血清学标志物、 HCV抗体、 HIV抗体、 TP抗体,2012年,医疗机构要落实手术、住院、血液透析、侵入性诊疗患者的乙肝和丙肝检测，为易感人群和肝脏生化检测不明原因异常者提供检测服务。,2009年,2017年,4,专家资料,我国传染病流行特点,肝炎大国，接近1亿人病毒性肝炎携带者(患者) 乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等人口基数大，人与人之间传播概率大 新时代人际交往呈“泛滥”趋势，社交APP、广场舞交际等，推动STD呈上升趋势 医疗水平（如透析、内窥镜操作）不及欧美日，医院就诊负担却远高于发达国家 医患关系紧张，“医闹”盛行，对医护人员基本权益的维护做得远远不够,5,专家资料

3、,HBV感染的实验室诊断,6,专家资料,HBV拥有病毒界最复杂的检验套餐：病越不好治，检验指标越多,Dane颗粒,1,HBsAg：HBV感染筛查标志物 2,HBsAb：保护性（中和）抗体 3,HBeAg：病毒活跃复制，传染性强 4,HBeAb：病毒活跃复制趋于被控制 5,HBcAb：非保护性抗体，现症/既往感染 6,HBV DNA：病毒复制直接指标 7,HBcAg，前S蛋白，HBcAb IgM，HBV RNA、耐药突变，基因型,7,专家资料,为什么慢性乙型肝炎不能被根治？,cccDNA,共价闭合环状DNA(cccDNA）是HBV“老巢”，感染后进入肝细胞核，转录4种mRNA，编码9种病毒蛋白（

4、HBsAg、HBeAg、HBcAg、逆转录酶等）并逆转录出HBV DNA，复杂高效。,目前各种抗病毒药物均不能根除cccDNA。,Wang J, et al; Journal of Hepatology 2016 vol. 65:700710,8,专家资料,为什么会有那么多奇葩的“两对半” 、DNA结果？,HBsAg, HBeAg和HBV DNA的合成路径各不相同,1，0.8Kb：X蛋白 2，2.1Kb：HBsAg（大、中蛋白） 3，2.4Kb：HBsAg（主蛋白） 4，3.5Kb：HBeAg，HBcAg，逆转录酶rcDNA,ie:血清HBV DNA,9,专家资料,HBsAg “低值阳性” 结

5、果成因？,10,专家资料,“低值阳性” HBsAg来源：HBV感染自然进程,非活动性HBsAg携带者：血清低水平HBsAg需高灵敏试剂检出 绝大部分携带者HBcAb，进一步佐证感染过HBV 大部分感染者体内HBV被控制，为非活动性携带状态，HBsAg逐年降低，HBV DNA转阴（病毒不再复制，无需抗病毒治疗） HBsAg自然清除率每年1-2%，变为隐匿性HBV感染状态（HBsAg测不到） 如果试剂灵敏度足够高，仍可检出极低水平血清HBsAg 不宣过度解读HBsAg“低值阳性”结果的临床意义，设置治疗壁垒1,临床检验杂志，2018,36:43-5,11,专家资料,HBV感染的自然进程：5个阶段,

6、HBsAg- HBV DNA +/-,J Gastroemerol. 2013, 48:13-21 EASL J Heparnl. 2017,67:370-98,不同文献报道的检测值（log10 IU/mL）,12,专家资料,“低值阳性” HBsAg来源：检验试剂非特异性,任何一种诊断试剂：只能做到灵敏度和特异性最好的平衡，但熊掌鱼翅不能兼得 尤见于孕妇、老年人、自身免疫病患者等携带自身抗体或嗜异性抗体(1,2)。 若HBcAb()，进一步佐证是“假阳性”HBsAg,Clin Chem. 1990, 36(6)：892-4 2. 临床检验杂志,2018,36(7):539-41,一名女性不孕者

7、血清使用嗜异性抗体阻断剂（HBR）阻断前后的结果变化2,13,专家资料,“低值阳性”HBsAg来源：试剂缺陷,某医院发现可疑样本（2017-06) 试剂A：HBeAg+，HBcAb+，HBsAg- 试剂B：HBeAg+， HBcAb+，HBsAg+/ HBV DNA：106 IU/ml,HBsAg “ a” 决定簇（124-147 a.a.)：商品化试剂检测抗体针对的表位,试剂C：HBsAg 1300.52 IU/ml(0.05IU/ml为阳性） 试剂D：HBsAg 3383 COI( 1.00COI为阳性）,HBV基因和氨基酸序列分析：,进一步检测,14,专家资料,HBV DNA是HBV感染

8、最直接、特异性强和灵敏性高的指标,HBV DNA与乙肝两对半相辅相成，互为补充！ 高灵敏的HBV DNA和高灵敏的两对半是首选！,15,专家资料,“低值阳性” HBsAg来源：分析前中质控,检验操作未能遵循试剂说明书和实验室SOP 分析前因素：离心不充分等 血清纤维蛋白（？）干扰造成假阳性。 通常 HBcAb(-) 分析中因素：样本间或者仪器内部交叉污染 HBsAg临床意义更重要， 交叉污染更容易觉察 阳性样本浓度从5102-5105 IU/ml， 跨度达1000万倍 全自动检测仪污染实例1：仪器长时间不做清洁 全自动检测仪污染实例2：私自用次氯酸锅泡腾片配制洗液， 清洗样本和试剂钢针， 造成

9、针内壁洗液结晶， 发生携带污染,16,专家资料,“低值阳性” HBsAg来源：新生儿和疫苗,妈妈是“大三阳”，宝宝出生就进行HBV高效免疫球蛋白阻断，同时接种HBV疫苗。检测“两对半”和HBV DNA，发现HBsAg(+)，甚至HBV DNA(+)，是宫内就被传染？ 解答： 我国新近文献报道，在“大三阳”妈妈涎下的宝宝里，HBsAg、HBeAg和HBV DNA阳性率分别高达35.1%、94.3%和12.7%1。 但大多数指标在出生后8-12月之后转阴；仅有4.4%患儿阻断失败，感染HBV，这些患儿妈妈全是“大三阳”，而“小三阳”妈妈无宝宝感染。 新生儿静脉或脐血内HBV标志物来源复杂，不论检验

10、方法的灵敏度如何进步，仍难以辨别是新生儿自己的还是妈妈的,疫苗：主动免疫引起一过性的、低值阳性HBsAg抗原血症,1. BMC Infectious Diseases. 2016, 16(1):408,17,专家资料,如何管理HBsAg低值阳性的个体？,2015，中国慢乙肝防治指南,免疫抑制患者即使HBsAg低值阳性，也要密切监测HBV DNA，防止HBV再激活。 如果HBV低值阳性个体年纪较大，或伴随其他疾病感染，或有肝硬化，建议加强肝癌监测，并选用高灵敏度的试剂检测HBV DNA。,18,专家资料,HBV DNA检测贯穿整个慢乙肝随访和治疗始终,Modified from Gish RG,

11、et al.Antivial Res,2015,121,47-58,19,专家资料,HBsAg “阴性” 排除HBV感染？,隐匿性HBV感染（OBI）,OBI在不同类型患者的发生率【1-4】,1,Rinonce HT,et al. J Med Virol，2013，85（8）:1348-1361 2，庄辉，等中华内科杂志，2000，39(12)：801804 3，Cciola I ，et al, N Engl J Med，1999341：22-26 4,Wong DK ,et al.Hepatology，2011，54（3）:829-836.,对不明原因的肝炎患者还应进行高灵敏HBV DNA检

12、测，排除OBI。【2】,OBI 促进HCV感染者肝硬化和肝癌的发展，这两种病毒可能相互作用，使炎症加剧及加速肝硬化的进程。【3】,重庆市93625例献血者中检出了91例OBI 唐山市116741例献血者中检出35例OBI 四川地区135542份供浆者血清中检出12份OBI,20,专家资料,临床思考,关键点的HBV DNA水平，2015年中国指南有何更新？ 更加积极地开始抗病毒治疗。无论代偿性还是失代偿性乙型肝炎肝硬化患者，只要HBV DNA可检测到，均建议用核苷（酸）类似物抗病毒治疗。,临床抗病毒治疗对HBV DNA试剂的要求？ 灵敏度（LOD）：肝硬化患者、隐匿性HBV感染患者、免疫抑制治疗

13、HBV再激活患者等人群，血清低水平HBV DNA要能被“检测到”，以指导开始抗病毒治疗。 HBV DNA试剂灵敏度：AASLD、EASL指南：10IU/mL，中国指南：高灵敏度和高精度 准确性：几个重要的DNA水平检测须准确（2000、20000 IU/ml) 精密度（CV）：重复性要足够好，能反映1个log10 IU/ml (10倍）的动态变化，诊断抗病毒治疗是否获得病毒学应答，诊断出现病毒学突破，或诊断是否有HBV再激活。,21,专家资料,HCV感染的实验室诊断,22,专家资料,HCV：短命的RNA病毒,1975年：非甲非乙型肝炎（NANB）困扰人类 1978年：建立NANB大猩猩感染模型

14、 1989年：应用噬菌体展示技术，建立感染NANB大猩猩血浆cDNA文库，用感染NANB患者血清抗体进行筛选，得到1株NANB克隆20人类历史上第一次单纯依赖分子生物学手段发现病原体 2030年：逐步在人群中消亡（为什么？）,23,专家资料,丙型肝炎已经可以治愈,2014,2016,2018,推荐药物：逐渐简化、副作用小,疗效：趋向全基因型治愈,疗程：趋向短疗程,12-24W,8-12W,68%-100%,100%,4-8W,DAA药物治疗费用：4-7万元/3个月,24,专家资料,我国最强效且廉价的口服DAA药物的可及性不佳,将DAA药物纳入医保的省市,吉林 天津 山东 安徽 浙江,25,专家

15、资料,HCV感染的实验室诊断,血清学检测（serology) HCV抗体（抗，HCV) 筛查实验 确认实验 HCV抗原,核酸检测 （nucleic acid test, NAT) HCV RNA 定性 定量 基因型/亚型 DAA耐药突变（RAS）,现阶段主要矛盾不再是丙肝治疗难 现阶段主要矛盾是筛查力度仍不够大， DAA药仍不可及,26,专家资料,HCV Ab是首选筛查项目：既往现症感染标志物,EIA：酶免法 CLIU：化学发光法,Mayo Clin Proc. 2001. 76(9):911-20.,27,专家资料,HCVAb检验存在大量“低值阳性”结果,28,专家资料,不同品牌HCV Ab

16、试剂判断“低值阳性”不同,所有抗体检测试剂的局限性：灵敏度高、特异性差 阴性预测值高、阳性预测值低,/hepatitis/HCV /Lab Testing. htm Yang RF. et al. Clin Chim Acta. 2013. 426(11):95-101,29,专家资料,少数免疫力低下HCV感染者Ab低值阳性、甚至阴性（“血清学阴性”HCV感染）,来自PKUPH未发表数据,30,专家资料,HCV RNA：直接标志物，且早于抗体的产生,HCV RNA缩短窗口期,31,专家资料,治愈后的丙肝患者血清HCV Ab逐年减少,针对核心蛋白c22-3(A)

17、和NS4蛋白c14-1/2(B)的抗体滴度随时间降低,Clin Infect Dis 2005:40,32,专家资料,HCV RNA是抗病毒治疗重要指征,Strader D, et al. Hepatology 2004; 39: 1147；Farci P, et al. PNAS 2002; 99: 3081,33,专家资料,临床案例：到底能不能干细胞移植？,男，53岁，干细胞移植供者，身体健康，无输血史，无手术史（包括牙科治疗），无纹身。检测HCV抗体，结果为3.38 S/CO(阳性判定为1.0 S/CO)，请问该男子的HCV 抗体低值阳性结果可能的原因？可捐献造血干细胞吗？,A，试剂“假

18、阳性”结果 B，HCV 急性感染，抗体产生上不足量 C，免疫抑制患者感染HCV，抗体产生较少 D，HCV感染后自发清除，或抗病毒治疗后痊愈，HCV抗体逐年降低,如果一定要弄清楚该供者体内是否真正存在HCV抗体，该如何进行下一步试验？,后续更换其他HCV抗体试剂，进一步高敏HCV RNA检测，确定是否现症感染。,34,专家资料,传染病病原体高敏核酸检测在临床应用,35,专家资料,圣湘高敏肝炎核酸检测全自动解决方案,高敏乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 高敏丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（ PCR-荧光探针法）,36,专家资料,消除肝炎危害，精准检测先行，助力中国2030消除肝炎危害,契合国内外指南要求，精准指导临床治疗！,37,专家资料,圣湘生物高敏HBV DNA试剂更适合中国乙肝患者,数据来源：新型国产乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂的质量评价. 中华检验医学杂志,2013。,国产试剂与进口试剂性能相当，个别基因型检测准确