基因组测序的原理与方法

1、大规模基因组测序的原理与方法,胡松年 ,元素周期表的发现奠定了二十世纪物理、化学研究和发展的基础,元素周期表,“基因组序列图”将奠定二十一世纪生命科学研究和生物产业发展的基础！,“基因组”-生命科学的“元素周期表”,人体解剖图奠定了现,代医学发展的基础,生命的奥秘蕴藏于 “四字天书”之中,GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCC

2、ACCGCTTCTTCCtTCTCT,基因组学的基础理论研究,基因组学是要揭示下述四种整合体系的相互关系: 基因组作为信息载体 （碱基对、重复序列的整体守恒与局部不平衡的关系） 基因组作为遗传物质的整合体 (基因作为功能和结构单位与遗传学机制的关系) 基因组作为生物化学分子的整合体 (基因产物作为功能分子与分子、细胞机制的关系） 物种进化的整合体 (物种在地理与大气环境中的自然选择）,基因组学是一个大学科,“界门纲目科属种”，地球上现存物种近亿，所有生生灭灭的生物，无一例外，都有个基因组。 基因组作为信息载体，它所储存的信息是最基本的生物学信息之一；既是生命本质研究的出发点之一，又是生物信息的

3、归宿。 基因组学研究包括对基因产物（转录子组和蛋白质组）的系统生物学研究。 基因多态性的规模化研究就是基因组多态性的研究。 基因组学的研究必然要上升到细胞机制、分子机制和系统生物学的水平。 基因组的起源与进化和物种的起源与进化一样是一个新的科学领域。 基因组信息正在以天文数字计算，规模化地积累，它的深入研究必将形成一个崭新的学科。,基因组学是一门大科学,基因组的信息是用来发现和解释具有普遍意义的生命现象和它们的变化、内在规律、和相互关系。 基因组的信息含量高。基因组学的研究又在于基因组间的比较。 基因组学的复杂性必然导致多学科的引进和介入（各生物学科、医学、药学、计算机科学、化学、数学、物理学

4、、电子工程学、考古学等）。 基因组学研究的手段和技术已经走在生命科学研究的最前沿。 基因组信息来自于高效率和规模化所产生的实验数据。 人类基因组计划证明了基因组研究的迫切性和可行性。,基因组与生命之谜,基因组的产生与进化。 基因组DNA组分的变化、GC百分比、嘌呤：嘧啶守恒。 遗传密码的发生、发展和进化。 内含子（尤其是大于100，000 核苷酸的大内含子）剪出后的运输和降解。 最小内含子的生物学意义。 动物基因组与植物基因组在基因分布上的共性和个性。 物种衍变过程中基因组水平的变化。 基因组大小变化与遗传、分子、细胞机制的关系。 “JUNK DNA”的发生、分类、进化与功能。,大规模基因组测

5、序的几个支撑技术,Sanger双脱氧末端终止法 PCR 技术 DNA 自动测序仪的发展 生物信息学分析软硬件设施,“双脱氧末端终止”的含义,PCR（聚合酶链式反应）原理,反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、缓冲液 每个循环包括：变性（90）、退火（54 ）、延伸（72 ）,Sanger 双脱氧末端终止法测序原理,大 规 模基因组 测 序 的 两 种 策 略,逐步克隆法 （Clone by Clone） 全基因组霰弹法 （Whole Genome Shot-gun),ATGCCGTAGGCCTAGC TAGGCCTAGCTCGGA,ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA

6、,基因组DNA,BAC文库,根据物理图谱正确定位的BAC 或contig,用于霰弹法测序的候选克隆,用于霰弹法测序的亚克隆,测序并组装,完整的基因组序列,逐步克隆法（Clone by Clone）,全基因组霰弹法 （Whole Genome Shot-gun),基因组DNA,霰弹法克隆,测序并进行全基因组序列组装,完整的基因组序列,两种大规模基因组测序策略的比较,BAC by BAC,Whole Genome Shotgun, the sequencing of the human genome is likely to be the only large sequencing project

7、 carried to completion by the methods described in this issue. Maynard V. Olson , The maps: Clone by clone by clone , Nature 409, 816 - 818 (2001),“Working Draft” (90%; 4X),Finished Genome (99.99%; 8X),Gap1,Gap2,Chromosome,工作草稿（框架图）与完成图,BAC by BAC,The sequence of the human genome C. Venter et al. Sc

8、ience 16 Feb. 291: 1304 1351, 2001,人类基因组计划研究的主要成果和进展表现在这“四张图”上,遗传图谱 又称为连锁图谱（linkage map），指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离 物理图谱 以定位的DNA标记序列如STS作为路标，以DNA实际长度即bp、kb、Mb为图距的基因组图谱。 转录图谱 利用EST（expressed sequence tags 表达序列标签）作为标记所构建的分子遗传图谱 序列图谱 通过基因组测序得到的，以A、T、G、C为标记单位的基因组DNA序列,逐步克隆法（Clone by Clone),物理图谱的构建,大片段克隆的筛

9、选,霰弹法测序与“工作框架图”的构建,序列的全组装与“完成图”构建,物理图谱的制作,物理图谱的制作序列标签位点（STS）作图,物理图谱是以特异的DNA序列为标志所展示的染色体图。标志之间的距离或图距以物理距离如碱基对（base pair；bp，Kb , Mb)表示。最精细的物理图是核苷酸顺序图，最粗略的物理图是染色体组型图。 STS图谱是最基本和最为有用的染色体物理图谱之一，STS（Sequence Tagged Site)本身是随机地从人类基因组上选择出来的长度在200300bp左右的特异性短序列（每个STS在基因组中是唯一的，STS图谱就是以STS为路标（平均每100Kb一个），将DNA克

10、隆片段有序地定位到基因组上。,STS的来源,随机基因组序列 表达基因序列，如EST 遗传标记序列，如微卫星标记,有关STS的信息可在基因组数据库GDB中找到 http:/gdbwww. gdb. org,物 理 图 谱 构 建 的 步 骤,确定各STS序列及其在基因组中的位置 大插入片段基因组文库的构建（BAC文库） 以特定STS为标记筛 选并定位克隆 含有STS的克隆在基因组中排序,基因组数据库（GDB）中至少含有24568 个STS路标信息,关 于 文 库,作为载体的基本要求,能在宿主细胞中进行独立的复制 具有多克隆位点，可插入外源 DNA片段 有合适的筛选标记，如抗药性 大小合适，易于分

11、离纯化 拷贝数多,文库的概念 含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体,载体：能携带外源DNA进入宿主细胞的工具，常用的载体有质粒载体、噬菌体载体、细菌人工染色体等,宿主：能容纳外源DNA片段的生物体，常用的有大肠杆菌、酵母等,BAC文库的构建,NotI、SacI,脉冲场凝胶电泳得200Kb左右的大片段DNA,纯化后与载体连接,电转化，将连接产物导入大肠杆菌感受态细胞,插有外源DNA片段的BAC载体,在含有氯霉素的固体培养基中培养,每一个菌落为带有相同外源DNA片段的单克隆,BAC克隆的筛选,“STS-PCR反应池”方案筛选种子克隆,特定的STS标记,相互间具有重叠片段的BAC克隆

12、根据STS信息组装成contig，并定位于基因组上,Contig,每一个菌落为带有相同外源DNA片段的单克隆,Regional mapping,Regional mapping,Minimal tiling path selected for sequencing.,Regional mapping,Beijing Map,共48个,每组 8 个,每8个96孔板组成1个superpool，384个96孔板组成48个superpools,48 superpools,Column pools Row pools,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,第八板,第二板,Plate po

13、ols第一板,plate pools，row pools，column pools的构成,“STS-PCR反应池”方案（Pooling Protocol）,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,超级池（8个96孔板，共768个克隆）,板池（96个克隆）,行池（12个克隆）,列池（8个克隆）,大大减少筛选的工作量，降低成本，所得筛选结果准确可靠,28 VS 768,sheet of superpools, plate pools, row pools, column pools,一 BAC Screening 前48个样品为引物OGG1.51对superpool(sp)的筛选结果

14、 后48个样品为引物OGG1.52对superpool(sp)的筛选结果,引物OGG1.52对应sp#27,34,45的plate,row,column pools的筛选结果,BAC clone 确定 (+为阳性克隆),引物OGG1.52的Colony-PCR,延 伸 克 隆 的 筛 选,STS的密度尚未达到绘制高精度物理图谱的要求，且在基因组中的分布不均匀，造成很多区域没有阳性克隆覆盖,形成空洞。因此需用指纹图谱（FPC法）或末端序列（Walking by End Sequence)步移等手段对种子克隆进行延伸，形成连续克隆群。利用延伸方法筛选得到的克隆称为延伸克隆。,Contig 1,Co

15、ntig 2,重叠序列,重叠序列,延伸引物,筛选到的延伸克隆,Molecular weight marker every 5th lane,BAC clones 在96深孔 板中培养 - Hind III 完全酶切 - 1% 琼脂糖凝胶电泳,指 纹 图 谱 法 （Walking by Fingerprinting database）,挑取靠近空洞的种子克隆，酶切构建其指纹图谱，在FPC数据库中进行比对，搜索含有此克隆的重叠克隆群信息，从中确定覆盖空洞区域的克隆，达到延伸目的。,Hind III 完全酶切,Hind III 完全酶切,FPC数据库中比对,Clone A,Clone B,Clone

16、 C,C,A,B,contig搭建中克隆的错位,末端序列步行法 （Walking by End Sequence） 挑取靠近空洞的种子克隆进行末端测序，然后在基因组数据库中进行比对，确定专一性的序列片段作为新的STS路标。最后设计新路标的PCR引物，按照STSPCR“反应池”方案筛选新的克隆，达到延伸的目的 。,克隆350A18序列输入 end sequence database的查询结果,四、Clone Identification 1、STS-PCR 2、BAC end sequencing 3、Fingerprinting 4、FISH,CK2,CK1,CK2,CK1,13f06,267

17、l16,481o07 250a15,204c23,340j13,对15个克隆进行HindIII酶切后电泳结果,“工作框架图”绘制,根据序列与STS database进行blastn比较结果，将克隆定位末端序的比较， 判定延伸在contig外的一端序列。并可及时进行walking，筛选新的克隆,霰弹法测序组装与Finishing,工作流程图,Shotgun Sequencing I :RANDOM PHASE,Bac Clone: 100-200 kb,Sheared DNA: 1.0-2.0 kb,Sequencing Templates:,Random Reads,Shotgun Seque

18、ncing II:ASSEMBLY,Consensus,Consensus,Shotgun Sequencing III: FINISHING,Consensus,Shotgun Sequencing III: FINISHING,Consensus,Shotgun Sequencing III: FINISHING,Consensus,Shotgun Sequencing III: FINISHING,Shotgun Sequencing III: FINISHING,Consed软件显示序列组装结果界面,1、Filling “intraclone gaps”,Gap filling by

19、end sequences,2、Filling “interclone gaps”,The actual and predicted fingerprint of R-260J13 digested with HindIII Lane 1: marker, Lane 2: R-260J13 digested with HindIII, 3 : the predicted,克隆211B19组装后的序列的错误率为零,Whole Genome Shotgun,This bacterium has a circular genome structure with 2,689,445 base pair

20、s, the second largest one of thermophiles decoded completely to date.,Circular representation of the genome of T. tengcongensis,What is under heaven is for all. Sun Yat-sen, the father of modern China,天下为公, DDBJ/EMBL/GenBank:AAAA01000000,国际一流测序生产线 7万克隆，3000万碱基/天 高产出、低成本： $/bp￥/bp美分/bp分/bp,基因组学： 数据导向

21、的大科学 有数据才是硬道理,世上无难事 只要肯登攀,Contigs:127,550 (N50=6,688 bp),Scaffolds: 102,444 (N50=11,764 bp),Quality: 546 bp at Q20,测序平台的构成,大 规 模 测 序 平 台 的 构 成,文库组 培养组 模板组 电泳组 反应组 MegaBACE 上机组 数据处理组,基因组随机文库的构建,测序模板的制备,测序反应与纯化,反应产物上机测序,序列数据的接收、质量评估、 组装等,含有质粒载体的大肠杆菌培养,检测模板质量与测序定量,文库组,各种物种DNA的提取 载体的制备 大片段文库(BAC、Cosmid)

22、 的构建 霰弹法文库(pUC18)的构建 文库质量的检测 转化 文库的保存,霰弹法文库与BAC文库的区别,霰弹法文库构建过程,超声：打断基因组DNA，电泳检测超声效果 纯化、末端补平：片段化的DNA纯化，并用T4 DNA聚合酶补平末端 电泳：1%琼脂糖凝胶电泳，切下含1.6-2.0 kb、2.0-2.5 kb及2.5-3.0kb 的DNA片段的凝胶 回收：用QIAEXII GEL Extraction Kit 回收试剂盒从胶中回收DNA片段 连接：用T4 DNA连接酶连接DNA片段和用SmaI酶切后的pUC18载体 电转化：连接产物用细胞导入仪电转化入感受态大肠杆菌 涂平板、重组子筛选：培养1

23、8小时候观察蓝白斑，白斑为重组克隆,培 养 组,96孔板培养基的分装 挑取克隆 过夜培养 菌液生长的检测 离心 4度贮存,国产96自动分液器,培养用96孔深孔板,培养组,分装培养基： 8道瓶口分液器 1分钟/板 出错率高 工作强度高,国产96自动分液器 30秒/板 杜绝错误 轻松一按,VS,VS,模 板 组,负责测序反应模板DNA的制备。采用碱裂解过膜法从转化获得的目的重组子大肠杆菌中提取目标产物插入外源DNA片段的PUC18质粒,步骤：,培养好的克隆,加 I 液（ 含Tris 、EDTA ）悬浮大肠杆菌,加 II液（ 含NaOH、SDS ）裂解大肠杆菌，并使DNA、蛋白质变性,加 III液（

24、 含乙酸钾、乙酸 ）中和，并使DNA复性,反应液过膜,收集滤液，弃膜,质粒DNA的纯化,模板组,96孔醋酸钾法(1999年) 96孔亚精胺法(2000年) 96孔Millipore过滤膜法(2001年) 96孔自制醋酸纤维吸附膜法(2002年) 384孔过膜法(2002年?) 全部试剂及耗材的国产化,电 泳 组,检测模板质量： 条带超过Marker的为小片段，空孔、弱孔和小片段均为不合格模板 测序定量： 与Marker比较条带亮度，建议测序反应模板用量,反应组,测序模板检测 反应试剂与引物检测和分装 反应及纯化 样品溶解 96孔板反应(1999年) 384孔板反应(2000年),MegaBAC

25、E上机组,上机样品的分装 上机试剂的分装 上机 数据传送 设备的保养与维护,数据处理组,数据接收 序列质量评估 序列组装 序列Finishing 数据备份 自动化程序的编制,优化组,新技术的资料收集与分析 新方法推广的技术支持与监督 大片段文库技术的建立 模板制备方法的改进 反应体系的优化 上机参数与试剂使用的优化 384孔板的全线使用,配液组,各组配制各种试剂 提高工作效率 降低溶液配制的出错率 减少浪费,生产辅助组,挑菌 卫生清洁 器皿清洗 孔板回收再利用 滤板制备 测序模板保存,Solid reads assembly strategy,- Assembly 4 total mismat

26、ches (m4): 13783 Coverage analysis of 13645 common SNPs: Total coverage:37939:33197; m6m4:3744 m6=m4: 9879; m6m4: 22 For the 10,864 SNPs only detected by m6 : 76.11% of SNPs in all SNPs datasets (m4) 40.64% of SNPs (distance=1) all SNPs datasets (m4),The mate-paired libraries summaries,Summary of ma

27、te-paired libraries,Sequence coverage (good mate-paired reads, AVR3SD)=26957176 * 50/380000000= 3.55 ,Average clone coverage of each base is 295.58 93% of total bases is bridged by =10 good mate-paired reads 75% of total bases is bridged by = 100 good mate-paired reads,Syntenic region detection usin

28、g mate-paired libraries,Depth-100 threshold means each base in syntenic region is bridged by at each 100 good mate-paired reads,The detected syntenic regions at two clone coverage thresholds (depth-10,depth-100),Length distribution of syntenic region in depth-100 threshold,N50=60,905 bp,Small indels

29、 detection using mate-paired reads (1),88.80%,13 bp indels are the major type of small indels,Each type of small indel has comparative average indel reads coverage and +/+ (%) (Implying the comparative detection sensitivity with SOLiD mate-paired reads ?),Small indels detection using mate-paired rea

30、ds (2),Average coverage 2.77 27 coverage: 28532/99.4% 16058/99.0% (+/+),Small indels are located at regions with lower sequence coverage,Small indels detection using mate-paired reads (3),1k+3k+6k,Calling for more mate-paired reads !,Small indels detection using mate-paired reads (4),Genomic distrib

31、ution of indels in non-overlapped rice fl-cDNA,1. Only 2.07% of 8621 indels are in CDS; 2. CDS region has relative high percentage of 3n indels; (CDS, 48.1%; UTR, 21.2%; Intron, 16.1%) 3. 3n indels (-9,-6,-3,+3 bp indels) may have little effect on gene function,The utilities of mate-paired library (

32、summary),“Good” mate-paired reads: (both ends are mapped on reference with reasonable distance, order and orientation) SNPs identification ( powerful for “SNP forests”) clone coverage estimation (synteny detection) “Bad” mate-paired reads: structural variation detection Single end unique mapped mate

33、-paired reads: small indels identification scaffolding target assembly in variation regions SNPs identification ! High quality unmapped mate-paired reads: scaffolding target assembly in variation regions,Consensus regions covered by the fragment and mate-paired reads,SNP identification in consensus

34、regions (1),raw SNPs : 1,390,332 (The consensus base was not heterozygotes) filter-1 SNPs: 583,013 (coverage =2 fragment reads 2. Higher relative frequency of CDS-3 in CDS region is reasonable and biological meaningful; 3. The specificity and sensitivity of SOLiD SNPs identification need both further analysis and experimental confirmation with Sanger sequencing strategy,Important issues should keep in the mind,The analysis of next-genera