高效液相色谱分类及工作原理

1、第三章高效液相色谱(HPLC)、生物材料和生物液体是目前已知的复杂化学物质的混合物，含有10，000多种分子量在1800万到几百万之间的成分，有意义的化学成分含量通常很低。因此，有必要有一种高分辨率和高灵敏度的分离和鉴定方法。气相色谱和高压液相色谱具有上述特征。它们可以提取、分离、分析和量化生物样品和生物体液样品的相关成分，并对疾病、病理原因和体内药物代谢的早期快速诊断进行研究。高压液相色谱特别有利于低挥发性、热稳定性差和高分子量的高分子量化合物和离子化合物的分离。如氨基酸、多肽、蛋白质、生物碱、核酸、类固醇、脂类、维生素、抗生素等。可以被分离、分析和量化。第一节高效液相色谱概述1。理论基础：

2、速率理论，A是涡流扩散项，B/u是分子扩散项，Cu是传质阻力项。高效液相色谱技术、高压输液泵、高效微粒固定相和高灵敏度检测器。第三，高效液相色谱具有高压、高速、高效、高灵敏度和样品回收方便等特点。与经典液相色谱和高效液相色谱相比，与气相色谱相比，高效液相色谱的优点是分析对象范围广，气相色谱只限于分析沸点较低的气体和化合物；高效液相色谱不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于沸点高、热稳定性差、摩尔质量大的物质。原则上，除了永久性气体，几乎所有的有机和无机化合物都可以分析。气相色谱的流动相只起到携带的作用，对组分不产生相互作用力；高效液相色谱的流动相产生相互作用力，相当于增加一个参数来控制和改善分

3、离条件。它通常在室温下操作。气相色谱通常在较高的温度下进行。缺点：设备昂贵，操作严格。第二节高效液相色谱的主要类型：1 .液-液分配色谱(LLPC)在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体，可用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性还是非极性、水溶性还是油溶性、离子型或非离子型。分离原理液-液分配色谱的分离原理与液-液萃取的基本相同，它根据物质在两种不互溶液体中的溶解度不同而具有不同的分配系数。不同之处在于，液-液色谱的分布是在柱中进行的，因此这种分布平衡可以重复进行，导致每种组分的不同迁移，提高分离效率，从而分离各种复杂的组分。2.液相色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有：(1)全多孔

4、载体：直径约100米的全多孔颗粒，由硅胶、硅藻土等材料制成。这种固定相的特点是颗粒细、孔浅、传质速度快、效率高、速度快。特别适用于复杂混合物的分离和痕量分析。(2)表面多孔载体(薄壳微球载体):由直径30-40m的实心玻璃球和厚度约1-2m的多孔外层组成，目前该载体的粒径为5-10 m，这种固定相多孔层厚度小、孔隙浅、相对死体积小、峰值快、柱效高，颗粒大、渗透性好、易装柱、梯度洗脱时平衡快，适合常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量有限。化学键合固定相：通过化学反应将各种有机基团键合到载体表面的方法。它取代了固定液的机械涂层，因此它的出现在液相色谱的快速发展中起着重要的作用，可以认为它是液相色

5、谱的一个重大突破。它是目前应用最广泛的固定相。据统计，超过3/4的分离问题是正相分配色谱：流动相的极性小于固定相，适用于极性化合物的分离。流出顺序是极性小，然后极性大。反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性，适用于非极性化合物的分离，流出顺序与正相色谱相反。2.液-固吸附色谱(LSAC)使用固体吸附剂作为固定相，通常是表面带有吸附中心的多孔固体颗粒。实质上，液-固色谱是基于物质在固定相上的不同吸附作用。1分离原理，当流动相通过固定相(吸附剂)时，吸附剂表面的活性中心将吸附流动相分子。同时，当样品分子(x)被流动相带入柱中时，只要它们在固定相上有一定程度的保留，它们就会取代相同数量的吸附的流

6、动相溶剂。)因此，NSad=Xad Ns的竞争吸附发生在固定相的表面上，并且当达到平衡时，存在Kad，其中Kad是吸附平衡常数，并且较大的值表明组分在吸附剂上具有强保留并且难以洗脱。Kad值越小，保留值越弱，越容易洗脱。据此，样品中的组分被分离。Kad值可以从吸附等温线数据中获得。液固吸附色谱中使用的固定相主要是具有不同吸附活性的吸附剂，如硅胶、氧化铝和多元酸胶。硅胶具有线性容量高、力学性能好、不溶胀、不与大多数样品发生化学反应等优点。因此，硅胶是最常用的。目前，最广泛使用的是510米全多孔颗粒填料。3。流动相，在吸附色谱中通常称为洗脱液。在吸附色谱中，高极性洗脱液通常用于高极性样品。对于弱极

7、性的样品，应使用弱极性的洗脱液。离子交换色谱是一种利用离子交换原理和液相色谱技术相结合来测定溶液中阳离子和阴离子的分离分析方法。所有能在溶液中电离的物质通常都可以用离子交换色谱法分离。它不仅适用于分离无机离子混合物，也适用于分离有机物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围很广。1离子交换原理，离子交换色谱利用不同待测离子的亲和力差异来实现分离。固定相是离子交换树脂，其上分布有固定的带电基团和自由平衡离子。待分析物质电离后产生的离子可以与树脂上的自由平衡离子进行可逆交换，交换反应的通式如下：阳离子交换：阴离子交换：通式：R-AB RBA，当达到平衡时，平衡常数用浓度(离子交换反应

8、的选择性系数)表示，其中氩和溴分别代表树脂相中洗脱液离子(A)和样品离子(B)的浓度。 硼的离子交换容量越大，越容易保留，越难洗脱。 一般来说，硼离子的电荷越大，水合离子的半径越小，钾钠比越大。2.固定相(1)多孔离子交换树脂主要是聚苯乙烯和二乙烯基苯基的交联聚合物，直径约520米，可分为微孔型和大孔型。(2)薄膜离子交换树脂是一种12米厚的树脂层，凝聚在直径约30米的固体惰性核上。(3)表面多孔离子交换树脂它是一种固体情感核心，表面覆盖一层微球硅胶，然后涂上一层离子交换树脂。(4)离子交换键合固定相它利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是粘合薄壳型，其载体是薄

9、壳玻璃珠。另一种是粘结颗粒载体型，其载体是多孔颗粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，具有机械性能稳定的优点，可以使用小粒径固定相和高col通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和酸碱度，可以控制钾值和改变选择性。有时将有机溶剂如甲醇或乙醇与水缓冲溶液混合，以提高比选择性和样品的溶解度。如果盐离子浓度增加，样品离子的竞争吸附能力将降低，从而降低其在固定相上的保留值。取决于不同的情况。例如，当分离有机酸和碱时，这些酸和碱的解离度可以通过改变流动相的酸碱度来控制。提高酸碱度会增加酸的离子化程度，降低碱的离子化程度。降低酸碱度会导致相反的结果。然而，在任何情况下，只要电离程度增加，样品的保留率就会增加

10、。酸碱度的影响离子对色谱法是分离和分析强极性有机酸和有机碱的良好方法。离子对色谱是一种将一个(或几个)带有相反电荷的离子添加到溶质离子(称为反离子或反离子)到流动相或固定相中，与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子的保留行为的色谱。由于离子对化合物A-B的疏水性，它们被非极性固定相(有机相)萃取。组分离子的不同性质、它们与抗衡离子形成离子对的能力以及形成的离子对的不同流动水性质导致每组分离器在固定相中的保留时间不同，从而导致不同的峰。这是离子对色谱分离的基本原理。流动相：含抗衡离子的极性溶液可以通过改变流动相的酸碱度、抗衡离子的浓度和种类来改变分离的选择性。固定相：非极性疏水键合相；5.离

11、子色谱(IC)，抑制型：抑制型和连续抑制型分离柱中离子交换树脂的交换容量通常为0.010.05毫摩尔/克干树脂，而非抑制型：应进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂)。检测器可直接连接到分离柱，无需抑制柱。离子色谱装置类型，离子色谱连续抑制装置图：样品通过分离柱后，通过抑制柱，将背景电导高的流动相转化为背景电导低的流动相，从而可以通过电导检测器直接检测各种离子的含量。如果样品是阳离子的，则使用无机酸作为流动相，抑制柱是高容量的强碱性阴离子交换剂。样品经阳离子交换剂分离后，以流动相进入抑制柱，在抑制柱中有两个重要的反应。从反应中可以看出，在通过抑制柱后，一方面，大量

12、的酸被转化成电导率非常小的水，这消除了流动相背景电导率的影响。同时，样品中的阳离子M被转化为相应的碱，由于氢氧离子的浓度是氯离子的26倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。阴离子样品也有类似的作用机制。离子色谱的应用：阴离子分析：双柱：薄壳阴离子交换树脂分离柱(3250毫米)，流动相：0.003摩尔-1碳酸氢钠/0.0024摩尔-1碳酸钠，流速：138毫升/小时。7种阴离子在20分钟内几乎完全分离，每种成分的含量为350 ppm。空间排阻色谱主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法不同，它没有吸附、分配和离子交换机制，而是根据样品分子的不同大小和形状实现分离。固定相有很多种，排阻色谱固定相一

13、般可分为软凝胶、半硬凝胶和硬凝胶。凝胶是指含有大量液体(通常是水)的柔软且有弹性的物质，它是一种交联后具有三维网络结构的聚合物。(1)软凝胶，如葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶，具有小的交联结构，它们的微孔可以吸收大量的溶剂，并膨胀到其干燥体的许多倍。它们适用于使用水溶性溶剂作为流动相，通常用于分析小分子质量物质，但不适用于高效液相色谱。(2)半刚性凝胶，如高交联度的苯乙烯凝胶，比软凝胶稍耐压力，其溶胀性能不如软凝胶。有机溶剂通常用作流动相。当用于高效液相色谱时，流速不应太大。(3)刚性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃等。它们可以使用水溶性溶剂和有机溶剂作为流动相，并且可以在较高的压力和流速下操作。一般情况下，控制压力小于7MPa，流量为1cm3s-1。否则，凝胶的孔径会受到影响，导致分离不良。排阻色谱中使用的流动相必须能够溶解样品，并且与凝胶本身非常相似，以便润湿凝胶。当使用软凝胶时，溶剂也必须溶胀凝胶。溶剂的粘度应该小，因为高粘度溶剂经常限制分子扩散并影响分离效果。常用的流动相包括四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基胺和水。3分离原理，空间排阻色谱法是一种根据分子大小顺序进行分离的色谱方法。凝胶中有一定大小的孔