微生物代谢调控理论及其在微生物发酵中的应用

1、微生物代谢调控理论及其在微生物发酵中的应用,北京林业大学生物学院食品科学与工程系 欧阳杰,微生物具有高度适应环境和自我繁殖的能力，它们有一整套可塑性极强和极精确的代谢调节系统，以保证上千种酶能准确无误、有条不紊地进行极其复杂的代谢反应。,微生物对环境给予的信号能在细胞的各种结构的协助下迅速作出反应，导致微生物的生理活动过程高度地统一起来。 微生物内外环境的统一是通过代谢调节的方式来实现的。,主要内容,1 初级代谢和次级代谢 2 代谢调节的部位和有关的酶 3 反馈调节 4 代谢调节控制的基本思想 5 糖代谢与控制 6 氨基酸代谢与控制 7 抗生素代谢与控制,1 初级代谢和次级代谢,生物细胞在新陈

2、代谢过程中，获得了许多重要的代谢产物: 初级代谢产物 中间代谢产物 次级代谢产物,初级代谢产物： 微生物由延滞期进入对数生长期，在对数生长期形成的产物往往是细胞自身生长所必需的，如各种氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类及糖类等，称为初级代谢产物或中间代谢产物。,由于初级代谢产物是供菌体生长繁殖使用的，所以野生菌株合成产物的量在满足自身需要后，就受到许多调节机制的控制而停止合成。 为了提高产量，就要了解菌株在合成产物中所受到的调节机制，研究修饰菌体的遗传基因，改良培养条件，设法予以解除菌株自身的调节机制。,次级代谢产物： 进入稳定期后有些微生物合成的化合物在代谢中有明显的优势，这类自发产生的化合

3、物称为次级代谢产物。 只有在细胞处于不生长或缓慢生长状态时，才能实现次级代谢（非生长耦联型）。 次级代谢产物是由初级代谢的中间体合成的。,初级代谢途径往往是大多数微生物代谢中常见的途径，而次级代谢产物是只有少数微生物才能合成的。 许多次级代谢产物具有喆抗微生物的活性，有些是特殊的酶抑制剂，有些是生长促进剂，许多具有药物功效。,EMP 途 径,TCA 循 环,植物次级代谢产物途径： 酚类化合物 萜类化合物 含氮化合物,2 代谢调节的部位和有关的酶,生物体的新陈代谢活动都是在细胞内进行的，细胞内有成千上万种酶来进行复杂的代谢活动。 微生物细胞体内具有一整套精确、合理、经济、高效的代谢机制，细胞在合

4、成维持微生物生长繁殖所需的各种物质时，需要多少就合成多少，从不过多合成。,如当细胞中合成的某种氨基酸已达到合成蛋白质所需要的量时，这时信号马上反馈给合成体系，使其停止合成这种物质，直到这种物质被消耗到很低浓度时，才重新合成。,过量生产某些化合物对生产菌来说，是一种“病态”过程，其固有的调节机制随时可能恢复到有利于其生长繁殖的方向； 这也就是生产菌种经多次传代，其生产性能容易蜕变的原因之一。, 微生物代谢过程的自我调节表现为： 控制营养物质进入细胞 酶与底物的接触 代谢物的流向,微生物代谢自我调节的每一个环节都涉及到酶促反应的调节，因此微生物代谢的自我调节实际上就是酶调节。, 酶的调节方式 酶活

5、性调节：通过代谢途径中关键酶（或称限速酶）活性的调节来控制酶促反应的速率；,酶合成（即酶量）调节：通过对关键酶酶量合成的控制来控制酶促反应的速率。它们通常需要一些低分子物质存在，然后这种物质通过影响酶构型来影响活性。, 与代谢调节有关的酶： 同功酶：,能催化相同的化学反应，但酶蛋白的分子结构、组成却有所不同的一组酶,一般为寡聚蛋白。,人体某些组织中乳酸脱氢酶同工酶电泳示意图,同功酶的主要功能在于代谢调节。在分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶所催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。,别构酶：也称变构酶，它是代谢过程中的关键酶。通过效应物（

6、调节物）和酶的别构中心的结合来调节其活性，从而调节酶反应速度和代谢过程。,变 构 调 节,多功能酶：一般是指在结构上只有一条多肽链，但具有两种或两种以上的催化活力或结合功能的蛋白质。,3 反馈调节,反馈调节主要是指代谢过程的中间产物，或终产物对于代谢早期阶段上关键酶的抑制作用。 微生物通过反馈调节作用，按照自身的要求来改变自己的代谢。,终产物对代谢途径中的酶的抑制有两种结果： 抑制酶的活性 抑制酶的生成,已知有两种主要类型的反馈调节作用： 反馈抑制 反馈阻遏,反馈抑制： 指一生物合成途径的最终代谢物抑制那一途径的前面第一或第二个酶的作用，即当某一代谢产物达到一定浓度时会使酶的活性受到抑制，从而

7、使反应速度减慢或停止。 终产物和酶的调节位点结合，使酶的空间构象发生变化。,反馈阻遏： 抑制酶的形成，当代谢的最终产物大量存在时并达到一定浓度时，它就会同细胞中早已存在的阻遏物结合起来共同发挥作用，阻止了一个或几个反应步骤中酶的合成，从而抑制了产物的形成。,4 代谢调节控制的基本思想,在正常情况，微生物代谢产物由于反馈抑制和反馈阻遏是不会大量积累的。但自然界里常发现一些微生物产生了过量的代谢产物，这主要是由于这些微生物代谢机制失调造成的。 在工业发酵上，可运用遗传的和环境的控制和人为的代谢调节，使其产物大量积累。,所谓代谢控制发酵，就是人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢活动，使目的

8、产物大量生成、积累。, 改变微生物代谢调节的方法： 采用物理化学诱变，获得营养缺陷型，这是氨基酸生产菌育种的最有效的方法。,营养缺陷型：指某菌种失去合成某种物质的能力，即合成途径中某一步发生突变，使合成反应不能完成，最终产物不能积累到引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或另一分支途径的末端产物得以积累。,营养缺陷型菌株的选育,应用抗反馈调节的突变株。由于这样的突变株不再受正常反馈调节作用的影响，使终产物得以积累。 利用营养缺陷型回复突变株或条件突变株的方法，解除终产物对关键酶的调节。,控制发酵条件，改变细胞的渗透性。 选育细胞膜通透性突变株，以便使终产物在细胞内不能积累到引起反馈调节的浓度。

9、,4.1 改变菌种遗传特性，切断支路代谢 4.2 解除菌体自身的反馈调节 4.3 增加前体物的合成 4.4 改变细胞膜的渗透性，去除终产物 4.5 发酵工艺条件的控制,4.1 改变菌种遗传特性，切断支路代谢 营养缺陷突变株的应用 例1 肌苷发酵： 通过代谢流的阻塞来消除终产物的反馈调节，以达到中间产物的积累。,PRPP ,3-磷酸核糖胺,5-IMP,XMP,SAMP,AMP,GMP,在AMP生物合成中，SAMP合成酶仅受AMP系物质的反馈阻遏；在GMP合成中IMP脱氢酶仅受GMP系物质的反馈阻遏和反馈抑制。与AMP、GMP合成共用的IMP生物合成有关的酶受AMP系、GMP系任一物质的反馈阻遏，

10、PRPP转酰胺酶受AMP的反馈抑制。,当选用腺嘌呤缺陷型（Ade）时，由于切断了IMP到AMP这条支路代谢，通过在培养基中限量控制腺嘌呤的含量，就可以解除腺嘌呤系化合物对PRPP转酰胺酶的反馈调节，因而可使鸟苷得以积累。,如果在Ade缺陷的基础上再诱变成黄嘌呤缺陷型（Xan）或鸟嘌呤缺陷型（Gua），那么就可以切断IMP到GMP这条支路代谢，通过在培养基中限量控制鸟嘌呤的含量，就可以解除鸟嘌呤系化合物所引起的反馈调节，从而增加肌苷的积累。,例2 赖氨酸发酵 在分支合成途径中，由于存在着多个终产物单独存在时都不能对其合成途径的关键酶实现全部的反馈抑制或阻遏这一现象，因此可以利用这种机制选育营养缺

11、陷型菌株，造成一个或两个终产物合成缺陷而使另外的终产物得以积累。,最典型的例子就是用高丝氨酸营养缺陷型（Hom）或苏氨酸营养缺陷型（Thr）菌株达到赖氨酸的积累。,代谢过程中的关键酶天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制，即天冬氨酸激酶在赖氨酸或苏氨酸单独一种存在时不受抑制，仅是当两者共存并都过量时才起抑制作用。,在苏氨酸限量培养时，即使赖氨酸过剩，也能进行由天冬氨酸生成天冬氨酰磷酸的反应。 在高丝氨酸缺陷型中，由于缺乏高丝氨酸脱氢酶，因而丧失了合成高丝氨酸的能力。,切断了生物合成苏氨酸和蛋氨酸的支路代谢，使天冬氨酸半醛这一中间产物全部转入赖氨酸的合成; 通过限量添加高丝氨酸，可使蛋氨酸、

12、苏氨酸生成有限，因而解除了苏氨酸、赖氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制，使赖氨酸得以积累。,例3 鸟氨酸发酵 利用营养缺陷型菌株发酵生产中间产物，如可以利用谷氨酸棒杆菌的瓜氨酸营养缺陷型（缺少转氨甲酰酶）进行发酵大量累积鸟氨酸。,谷氨酸 鸟氨酸 转氨甲酰酶 瓜氨酸 精氨琥珀酸 精氨酸,在利用瓜氨酸营养缺陷型进行鸟氨酸发酵时，首先要在发酵培养基中加入亚适量的瓜氨酸或精氨酸，维持该突变株的正常生长，这样，该菌株就能够不断地将葡萄糖等糖类物质转变成鸟氨酸。,由于该菌株缺失转氨甲酰酶，鸟氨酸不能转变成精氨酸，胞内的精氨酸不会积累，即不会产生反馈抑制与反馈阻遏。因此在发酵中鸟氨酸浓度可以达到26g/L。,

13、 渗漏突变株的应用 渗漏缺陷型就是指遗传性障碍不完全的缺陷型。,渗漏突变是使它的某一种酶的活性下降而不是完全丧失，因此渗漏缺陷型能够少量地合成某一种代谢最终产物，能在基本培养基上进行少量的生长。 由于渗漏缺陷型不能合成过量的最终产物，所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。,4.2 解除菌体自身的反馈调节 选用抗类似物突变株 应用抗反馈调节的突变株 由于这样的突变株不再受正常反馈调节作用的影响，使终产物得以积累。,正常合成代谢的最终产物对有关酶的合成具有阻遏作用，对于合成途径的第一个酶具有反馈抑制作用； 这是由于它能与阻遏蛋白以及变构酶相结合的缘故。,精氨酸便是利用抗类似物突变株进行发酵

14、生产的一种物质。 由于精氨酸的生物合成要受精氨酸本身的反馈抑制和反馈阻遏，要积累象精氨酸这样非支路代谢途径的终产物，主要采用抗精氨酸类似物突变株，如D-Arg抗性突变株等，以解除精氨酸自身的反馈调节，使精氨酸得以积累。,4.3 增加前体物的合成 在分支合成途径中，切除目的产物外的其他控制共用酶的终产物分支合成途径，增多目的产物的前体，使目的产物的产量提高。,例如：在赖氨酸发酵育种上，对已育出的解除了赖氨酸反馈调节的突变株，为了进一步提高赖氨酸的产量，可考虑增加丙氨酸营养缺陷等遗传标记。这是一种增加前体物积累的育种方法。,葡萄糖 丙酮酸 丙氨酸天冬氨酸赖氨酸,在乳糖发酵短杆菌中赖氨酸、丙氨酸的

15、生物合成途径及其调节,丙酮酸和天冬氨酸是赖氨酸和丙氨酸生物合成中共用的前体物。 虽然丙氨酸并不抑制赖氨酸的生物合成，但是丙氨酸的形成意味着赖氨酸前体物丙酮酸和天冬氨酸的减少。 因此育成丙氨酸缺陷型，切断丙氨酸的生物合成，就会提高赖氨酸的产量。,4.4 改变细胞膜的渗透性，去除终产物 微生物的细胞膜对于细胞内外物质的运输具有高度选择性。 细胞内的代谢产物常常以很高的浓度积累着，并自然地通过反馈阻遏限制了它们的进一步合成。,采取生理学或遗传学方法，可以改变细胞膜的透性，使细胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外。 这种方法解除了末端产物的反馈抑制作用，可以提高发酵产物的产量。, 通过生理学手段控制细胞膜的

16、渗透性 在谷氨酸发酵生产中，生物素的浓度对谷氨酸的累积有着明显的影响，只有把生物素的浓度控制在亚适量情况下，才能分泌出大量的谷氨酸。,生物素影响细胞膜渗透性的原因： 生物素是脂肪酸生物合成中乙酰辅酶A羧化酶的辅酶，此酶可催化乙酰辅酶A的羧化并生成丙二酸单酰辅酶A，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸。因此，控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的透性和影响谷氨酸的分泌。,当培养基中生物素含量很高时，只要添加适量的青霉素也有提高谷氨酸产量的效果。 青霉素可抑制细菌细胞壁肽聚糖合成中转肽酶的活性，结果引起其结构中肽桥间无法进行交联，造成细胞壁的缺损。,这种细胞的细胞膜在细胞膨压作用下，有

17、利于代谢产物的外渗，并因此降低了谷氨酸的反馈抑制和提高了产量。,通过细胞膜缺损突变而控制其渗透性 应用谷氨酸产生菌的油酸缺陷型菌株，在限量添加油酸的培养基中，也能因细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸的产量。,这是因为油酸是一种含有一个双键的不饱和脂肪酸（十八碳烯酸），它是细菌细胞膜磷脂中的重要脂肪酸。 油酸缺陷型突变株因其不能合成而使细胞膜缺损。,4.5 发酵工艺条件的控制 微生物发酵过程中，发酵条件既能影响微生物生长，又能影响代谢产物的形成。,例1：酒精发酵时 有氧条件菌体生长而不发酵产生酒精； 厌氧条件发酵产生酒精。,例2：谷氨酸发酵过程中 通气不足时，产生乳酸；通气充足时才产生谷氨酸； NH4浓

18、度适量时产生谷氨酸，缺乏时产生-酮戊二酸，过量时产生谷氨酰氨。,培养基成分是微生物生长和发酵产物形成的物质基础。 在调节培养基组成与各组成成分的比例时，既要考虑到保证满足机体生长的需要，又要有利于代谢产物的形成，同时还要考虑避免使用容易引起分解代谢产物阻遏的成分或避免使用大量的这种物质。,在发酵培养基中通常是采用适量速效氮源或碳源，以促进机体的生长； 又要有充足的迟效碳源或氮源，以利于发酵产物的形成，从而也可以避免速效碳源或氮源在机体内产生分解代谢产物阻遏。,例如在-淀粉酶发酵生产时，葡萄糖对枯草杆菌的-淀粉酶生产有阻遏作用，所以一般不用。 淀粉是缓慢地被利用的碳源，一般作为细菌和霉菌-淀粉酶

19、生产的碳源。,但是如果菌的淀粉酶活力强，淀粉会很快地分解为葡萄糖，造成葡萄糖积累，葡萄糖积累到一定程度也会产生分解代谢产物阻遏，因此可以采取分批补料的措施来控制淀粉的浓度。,什么是葡萄糖效应？,5 糖代谢与控制,微生物分解糖可归纳为有氧降解和无氧降解两大类型。 有氧降解的最终产物是CO2和H2O，同时产生大量能量。一条途径是通过EMP-TCA，一条是HMP途径。,柠檬酸发酵机制: 柠檬酸是微生物好气代谢途径的中间产物，一般并不积累。,EMP 途 径,TCA 途 径,D-葡萄糖 1,6-二磷酸果糖 丙酮酸 乙酰CoA 草酰乙酸 柠檬酸 苹果酸 -酮戊二酸,阻断,为了积累柠檬酸，柠檬酸合成酶、磷酸

20、烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶要强大，而顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶应微弱。 黑曲霉(Aspergillus niger)在柠檬酸发酵过程中，由于在培养基中限制添加氮源，导致顺乌头酸酶抑制处于较低水平，而柠檬酸合成酶的活性自始自终均较高，从而使得柠檬酸大量积累。,6 氨基酸代谢与控制,各种氨基酸的生物合成途径,6.1 谷氨酸发酵的代谢控制育种 D-葡萄糖 丙酮酸 柠檬酸 琥珀酰辅酶A -酮戊二酸 透过细胞膜 谷氨酸 谷氨酸,谷氨酸生产菌的育种思路： 切断或减弱支路代谢： 减弱-酮戊二酸脱氢酶复合酶系的活性，增强谷氨酸脱氢酶的活性，使代谢流向谷氨酸，从而使谷氨酸得到积累。 选用减弱HMP途径后段

21、酶活性的突变株；, 选用不分解利用谷氨酸的突变株； 选用减弱乙醛酸循环的突变株； 阻止谷氨酸进一步代谢。, 解除自身的反馈调节 选育耐高渗透压（耐高糖、高谷氨酸）的菌株； 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株；, 增加前体物的合成 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株； 选育强化CO2固定反应的突变株；, 提高细胞膜的渗透性 抗Vp类衍生物的突变株： 能遗传性地改变细胞膜的渗透性；,细胞膜的结构, 选育溶菌酶敏感性突变株 谷氨酸菌对溶菌酶都不敏感，用溶菌酶破壁时，首先用青霉素预处理后才能破壁。如果经诱变处理，使菌种对溶菌酶敏感，就使菌种的细胞壁网状结构变得疏松，渗透性变

22、大；, 选育二氨基庚二酸缺陷突变株： 这是谷氨酸菌细胞壁的组成成份，可使细胞壁合成不完整；,革兰氏阴性菌的细胞壁结构, 选育温度敏感突变株 谷氨酸温度敏感突变株的突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构的基因上，这样为基因所控制的酶，在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变., 选育强化能量代谢的突变株 谷氨酸高产菌的2个显著特点是： -酮戊二酸继续向下氧化的能力缺陷和乙醛酸循环弱，使能量代谢受阻； TCA循环前一阶段的代谢减慢。,强化能量代谢，可补救上述两点不足，使TCA循环前一段代谢加强，谷氨酸合成的速度加快。 选育呼吸抑制剂抗性突变株； 选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株； 抑制

23、能量代谢的抗生素的抗性突变株。,6.2 天冬氨酸族氨基酸的代谢控制与发酵 天冬氨酸族氨基酸包括天冬氨酸、赖氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。, 赖氨酸发酵 切断或减弱支路代谢：切断或减弱合成蛋氨酸和苏氨酸的分支途径，可达到积累赖氨酸的目的。 解除反馈调节：解除Thr和Lys对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制作用；, 解除代谢互锁： 在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸的生物合成与亮氨酸之间存在着代谢互锁。要解除这种代谢互锁，可以选育亮氨酸缺陷突变株，或选育抗亮氨酸结构类似物突变株。, 改善膜的通透性： 使Lys渗透到发酵液中，使产物在细胞内的浓度降低到不引起反馈抑制或阻遏作用的浓度。, 苏氨酸发酵 选

24、育赖氨酸缺陷型和蛋氨酸缺陷型，并要解除苏氨酸对天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶的反馈调节。, 蛋氨酸发酵 选育赖氨酸缺陷型和苏氨酸缺陷型，并要解除蛋氨酸自身的反馈调节，主要是通过选育抗蛋氨酸结构类似物突变株。另外要切断蛋氨酸向S-腺苷蛋氨酸的反应，选育SAM突变株。,6.3 芳香族氨基酸的代谢控制与发酵,色氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸,(EM途径 ) (HMP途径) ( DAHP合成酶) 3-脱氧-D-阿拉伯型庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP） 维生素K 预苯酸 苯丙氨酸 酪氨酸,葡萄糖,磷酸烯醇式丙酮酸 4-磷酸赤蘚糖,CoQ 莽草酸,分支酸 氨茴酸色氨酸,苯丙酮酸 对羟基苯丙酮酸,色氨酸发酵 切断由分支

25、酸到预苯酸、维生素K、CoQ的代谢支路，节约碳源，使中间体分支酸更多地转向合成色氨酸，同时可以解除Phe、Tyr对合成途径中DAHP合成酶的反馈调节，从而有利于色氨酸的积累。,具体可采用： 预苯酸缺陷 苯丙氨酸缺陷 酪氨酸缺陷 CoQ缺陷 维生素K缺陷等标记,选育色氨酸的结构类似物抗性突变株，解除其自身的反馈调节来达到积累色氨酸的目的。 增加前体物。 切断进一步代谢。,7 抗生素代谢与控制,抗生素是次级代谢产物，也要受到代谢调节的控制。 抗生素的化学结构比较复杂，合成所需的前体物质也较多，因此抗生素的合成代谢途径比氨基酸等的合成代谢复杂得多，并与初级代谢产物合成途径有着密切的关系。,通过对抗生

26、素合成机制的研究，许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物形成的，如谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、半胱氨酸等。,由氨基酸代谢还产生各种激素,糖代谢中间体既可以用来合成初级代谢产物，也可以用来合成次级代谢产物，把这种中间体叫做分叉中间体。 例如糖经EMP或HMP生成的乙酰CoA，进一步羧化就转变成丙二酰CoA。,丙二酰CoA在初级代谢中经过脂肪酸合成酶系的催化作用合成脂肪酸； 在次级代谢中则经过多次重复缩合、环化或闭环等生化反应，形成四环类或其它类抗生素。,因此丙二酰CoA就是分叉中间体。 其它分叉中间体主要有： 莽草酸、乙酰CoA、-氨基己二酸等。,由初级代谢产物衍生为次级代谢产物的基本代谢途径有7种： 葡萄糖碳架掺入途径； 莽草酸途径； 与核苷有关的途径；, 聚酮体和聚丙酸途径； 由氨基酸衍生的途径：如缬氨酸是合成青霉素的前体； 甲羟