第十二章 转基因动物和基因打靶

1、第十二章 转基因动物和基因打靶 第一节 转基因动物 一、概述 （一）基本概念 1.转基因（transgenesis） 是借助基因工程将确定的外源基因导入动植物的染色体上，使其发生整合并遗传的过程。 广义地说，向细菌、微生物、动植物细胞、动植物个体导入外源基因都可称之为转基因，所以转化（transformation）、转导（transduction）和转染（transfection）在转基因这个概念上得到了统一。 2.转基因动物（transgenic animal） 是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，外源基因能够表达并能稳定传代（按孟德尔定律遗传）的一类动物。,（二）基因工程技术的特

2、点 上个世纪70年代诞生的基因工程技术特点是“分子水平操作，细胞水平表达”，是把外源基因间接（载体介导）或直接转入细胞内，利用细胞这个报小的生物工厂达到生产或科研的目的。 这里基因转移的对象是细胞，转移过程是在细胞水平上进行的，目的只是把改造了单个细胞的遗传特性。 获得产品或进行实验研究需要大量的细菌培养或细胞培养技术。,（三）基因工程技术引起人们思考的3个问题 1. 能否跨越细胞水平，直接在机体整体水平上进行操作。 2. 能否培育高效表达基因工程产品的动植物，取代目前大量细菌培养和细胞培养呢? 如果获得这样的动植物，人们获得所需要的生物活性物质就像挤牛奶那么方便（如培育一种高效表达胰岛素动物

3、），只需定期从这个生物工厂收获就行了。 3. 能否利用基因工程技术创造高产，抗病和具有某种特殊性能的新品种乃至改造人类的基因结构呢？ 这就是我们学习和讨论本章的目的。,（四）转基因生物成就 转基因技术是在基因工程和胚胎工程的成就基础上发展起来的。这种20世纪50年代发展起来的细胞核移植技术，使人们可以从一个细胞中取出整个细胞核（含完整的基因组），并将其转移到去核卵中，此卵可发育生长成完整的个体，并带有外源性的全套基因。 1. 超级小鼠 1981年 Brinster和Palmiter将大鼠生长激素因子与小鼠金属硫蛋白的基因连在一起，构成MT1GH基因微注到小鼠受精卵中在植入假孕鼠子宫中发育生长共

4、产出21只小鼠，其中7只带外源基因，而其中6只小鼠大1倍左右，这即著名超级小鼠或巨鼠。,2.克隆羊 1997年2月“Nature”杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯林研究所和PPL生物技术向世界宣布1996年7月，他们培育出了一只名叫“多利”的“克隆羊”时，全世界震惊的程度不亚于当初对原子弹的爆炸，有人惊呼“克隆来了”。为什么？此克隆非彼克隆。,多利的诞生的过程 1. 取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。 2. 取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因，换上第一只羊乳腺细胞的基因（“掉包”）放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵进行细胞分裂到一定阶段，胚胎形成。 3. 将其移植到第三只母羊子宫中

5、发育，妊娠（同正常一样）产下“多利”，这样，一只与第一只羊百分之百一样的“复制品”诞生了。 不辨父母的“多利”的诞生，推翻了遗传学上一条上百年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个体。,二、 基本原理 转基因动物的基本原理是： 将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中使目的基因整合到基因组中然后将此受精卵或着床前的目的胚胎细胞再植入受体细胞输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物人们可以通过分析转基因和动物表型的关系揭示外源基因的功能，也可通过转入外源基因培养优良的动物品种。,三、基本步骤 研制转基因动物的基本步骤包括： 1.

6、转基因载体的构建 。 2. 通过显微注射等方法将外源基因引入受体胚胎或受精卵。 3. 通过胚胎（或受精卵）移植和基因型鉴定获得携带外源基因的转 基因动物。 4. 通过转基因动物的表型分析研究外源基因的功能。,四、转基因载体的构建及制备 （一） 载体 由调控序列和结构基因组成。选择基因组DNA构建转基因载体应能使外源基因在转基因动物中表达的可能性大，且更具有天然的组织特异性。 （二） 外源基因 包括目的基因和报告基因，二者拼接成融合基因。外源基因的cDNA序列内顺式作用元件和结构基因组成的完整的转录单位。 （三）启动子 选择可诱导的强启动子，如cre/LoxP、Flp/FRT及四环素应答调控系统

7、等。 （四）注射前载体应纯化、线化，尽可能去除酚、SDS等有害物质，减少对受体细胞的毒性。合适注射DNA浓度为15g/ml。,五、转基因动物常用的方法 为使外源基因进入种系（germ line），将外源基因转入受体（生殖）细胞，从导入基因方式划分，可有： （一）受精卵原核直接显微注射法 （二）胚胎多能干细胞介导法 （三）精子载体导入法 （四）逆转录病毒感染导入法 （五）电泳冲法 （一）（五）为直接法，（二）（三）（四）为间接法，每一方法各有其优缺点，技术成熟程度亦不相同。,（一）受精卵原核显微注射法 这是最早发展也是最有成效的一种外源基因直接导入的方法，迄今产生的许多转基因哺乳动物绝大多是通过

8、这个途径获得的。哺乳动物的受精卵极小，直径只有100150um，要将外源基因注入更小的原核内，必须应用显微注射仪上装置的纤维毛细管（直径0.51m）在显微镜下进行。,下面以Palmiter等人培育“巨型小鼠”的技术路线说明显微注射法的总体途径。 1.动物的选择 应选择： 产仔率高 基因背景一致的以利于： 1）显微注射 2）外源基因整合 3）表达的检测 品种或品系和受精卵原核清楚 并获得亲、子代转基因动物。(在小鼠，人们可选用ICR，C57等动物作为受精卵供体，另用昆明小鼠作为或供体) 2.受精卵的准备 供体准备 受精卵采集（交配后1416小时） 3.受精卵的显微注射 向雄原核内注入外源基因的拷

9、贝数几十至几千个不等， 但注入量衡定，一般液量每个原核不超过3皮升（pl）。 4.假孕受体的准备 5.胚胎移植于假孕受体宫腔内发育成熟（移植受精卵含有外源基因） 6.转基因动物的鉴定 包括： 1）外源基因的整合测定 (如点杂交、SouthernDNA杂交） 2）表达产物的检测（如Northern、Western试验、免疫荧光，免疫、中和试验、基因回归等） 3）生物效应的观察 标本为：DNA、RNA、血清、体液、乳、尿以及组织和细胞等。 7.纯系转基因动物的培育 迄今获得的转基因、外源基因大多为单条染色体整合。由于生殖细胞减数分裂，子代动物总有一部分不含有外源目的基因，且在垂直传递中也常发生丢失

10、现象。因此，为使子代动物稳定地携带外源目的基因，保持特定地遗传性状，必须根据整合测定的结果，按照孟德尔的经典遗传学定律，制定合理的纯系动物培育方案：将不同的雌雄转基因动物配对交配，筛选等位基因中均整合有外源目的基因的子代个体，即特定基因的纯系动物。,8.原核显微注射的优缺点： 优点： 外源基因在宿主动物染色体上的整合效率高，在小鼠和家兔， 整合率可达2530。 不要载体 由于外源基因是在雌雄原核融合之前导入的，外源基因的整合亦是在此期间整合到宿主染色体内，因此产生的转基因动物所有组织和细胞，包括抗体细胞和生殖细胞，经常有这一外源基因，且整合的位置和拷贝数基本上一样。 导入的外源基因长度可达50

11、kb，能够满足转基因动物的培养要求。近有导入长达100kb外源基因的报道。 缺点： 需要显微注射仪等精密设备，操作技术复杂，已导入外源基因的受精卵常需通过手术移至假孕受体的输卵管内。 某些动物的受精卵原核看不清楚，需要干涉相差显微镜（绵羊）或经1500g离心3分钟，使胞质浓染一端，才能暴露，这既增加了操作 复杂性，又影响了受精卵的成活率。 整合是随机的，宿主染色体常在整合部位发生突变，宿主基因也常被插入失活，从而导致许多转基因动物发生个体发育障碍、不育、死亡，甚至早期胚胎死亡的现象。,（二）胚胎干细胞介导 胚胎多能干细胞指胚胎囊胚期的内细胞团中尚未分化的胚胎细胞。这种细胞具有高度分化的潜能。

12、小鼠胚胎干细胞由美国剑桥大学Evans和Kauffman两个人1981年首先分离并体外培养成功（故又称EK细胞，EK为Evans和Kauffman两个字头的组合，也有人称这是embryonic karyotype的缩写）。胚胎多能干细胞法技术路线（总体途径）如下： 1.建立EK细胞系，多能干细胞分离。 各学者建立EK细胞系的技术路线不尽相同，但基本思路一致。 选择一定发育阶段的胚胎，因为只有该发育阶段胚胎在体外培养系统中才能生长。 培养条件要促进多能干细胞生长而不利于其它分化细胞的生长。如果胚胎已经着床，则分离比较困难，Evans创造了。 延迟囊胚法：通过改变母体激素和切除卵巢，延迟囊胚的着床

13、，使其内细胞团内数目增加，分离移植体外后，大量未分化干细胞正处于增殖阶段。,延迟囊胚体外培养12周后，可在饲养层上出现滋胚层、上皮样内胚层细胞和干细胞（EK细胞），据形态特征（体积小，具有一个大核和12个核仁）挑选，培养传代，建立EK细胞系。 2.EK细胞的特性鉴定 （1）核型鉴定： EK细胞应有整二倍体的核型，呈XX或XY型，并能在嵌合体中形成有功能的配子，小鼠EK细胞染色体总数为40。 （2）分化潜能的鉴定 在没有饲养条件，体外培养EK细胞呈悬浮生长，并聚集成许多团块简单类胚，随后形成囊胚，并出现神经、肌肉和软骨等紊乱的细胞和结构。 将EK细胞注入正常发育的囊胚中，EK将与受体的内细胞团一

14、起发育共同构成嵌合体。 将106109个EK细胞皮下注射至同种小鼠的胁腹部，将在36周形成由不同类型细胞形成直径达12cm的畸胎瘤。,3.转基因 以体外培养的EK细胞为桥梁，结合细胞遗传学及基因工程技术，定向改造这些细胞，如用不同的外源目的基因进行转化或转染，筛选其中已有外源基因并能高效表达的EK细胞再注入受体囊胚腔内，则由其发育而成的胚胎及个体的部分组织将整合内外源目的基因，并可能出现特异性表达。据统计，生殖细胞中整合外源基因的比率约30。通过对嵌合体动物的繁殖和筛选，即可获得整合有外源目的基因的转基因动物。 4.胚胎干细胞介导的优缺点 优点： 可以通过各种方法对EK细胞系体外进行外源基因的

15、导入。 转化细胞的鉴定和筛选比较方便，即使外源基因导入只有10-6， 也可以选出。 外源基因的整合数目、位点、表达水平与其调节及插入基因的稳定性的检定等均可在细胞水平进行，故预期性和可控程度都明显高于受精卵的显微镜法。 注射囊胚操作较简易，且囊胚可以通过非手术途径直接注入受体宫腔，胚胎存活率较高。 缺点： 建立、保存、维持EK系难度较大 导入受体囊胚后如果发生性嵌合，则将导致生殖机能紊乱合不育。,（三） 逆转录病毒感染导入 1.总体技术路线：将插入外源目的基因的逆转录病毒载体DNA 通过辅助细胞包装成感染滴度的病毒颗粒用来感染已经除去透明带的着床前胚胎随后直接导入受体子宫 2.优缺点 优点：

16、感染率高。100的细胞被感染，细胞损伤小，胚胎成活率高。 外源基因两端可连接逆转录病毒的LTR，有利于其转录。 逆转录病毒宿主范围广，适用于多种动物。 宿主染色体DNA在整位位点附近较少，发生缺失和重排，因此转基因动物也较少出现不育和其它生理异常现象。 缺点： 整合效率不高，外源基因特别不易整合到生殖细胞中去。 逆转录病毒的容纳量在10kb以下，所以不能插入较大的外源基因。 逆转录病毒的DNA序列可能干扰外源基因的表达。 对于逆转录病毒的长期感染或整合，应用增殖型逆转录病毒载体，人们还有疑虑，可导致转基因动物的病毒血症乃至死亡。,（四）精子载体导入 在正常受精的过程中，精子进入卵子，精子和卵子

17、分别形成雄原核和雌原核，随后两个原核融合完成受精的过程。 能否用精子作为载体导入外源基因，为转基因动物的培育提供一条简单的途径呢？ 上10年来有成功的报道，也有不成功的报道。 我国学者沈孝宙等人也发现精子有大量、稳定地吸附外源基因，又能自动、准确地寻找卵子地雌原核。他们以鲤鱼精子为载体成功地将人的生长激素基因导入成熟的鱼卵内，在孵出的千尾幼鱼中，经放免测定，50以上幼鱼表达了人的生长激素，生长速度为不表达鱼的两倍以上。鱼精子之所以可以吸附并向卵子内导入外源基因，可能在于其由雄鱼的泄殖孔射出后，不需获能而可以直接穿入卵子内。报道认为，精子携带外源DNA的能力，取决于其外包的一层糖蛋白是否去除彻底

18、。 （五）电穿孔 原理参见细胞转染。,六、外源基因的整合、表达和遗传 外源基因的整合机制 ：有下述报道。我们整理了一下，供大家参 考。 （一）外源基因自身的变化 1.实验证明，显微注射导入的外源DNA片段以许多亚单位首尾衔接形成串连物。其游离端可诱导产生DNA复制酶（引起宿主染色体某些位点的随机断裂处）。 2.外源基因之间可能发生同源重组现象，这是一种酶介导的。 3.外源基因也可能发生自我切除现象。 （二）宿主染色体的变化 因为外源基因的导入，宿主染色体DNA序列可以发生： 1.某些位点的随机断裂，外源基因就整合在随机断裂处。 2.插入外源基因的附近位点染色体序列DNA可以发生大片段的重排、缺

19、失、重复或易位。 3.外源基因插入使宿主内源基因直接遭受破坏，引起插入突变。,（三）外源基因整合进宿主染色体的拷贝数受： 1.供、受体细胞的种类。 2.外源DNA浓度和形式（线状或环状）。 3.注入部位（雌、雄原核或胞质）。 4.动物种类和属系。 （四）外源基因在整合前的成串相连的现象为非连接共转移的方法提供了依据，若2个基因，如目的基因和标志基因共转移可以共价连接导入，也可简单混合直接导入，任其自然成串，当然后者的可控性下降。,（五）外源基因的表达规律 从目前的资料看，似乎存在以下规律： 1. 外源基因表达似乎没有种属特异性 因为生长激素、干扰素、IL2R、类胶原，类MHC及球蛋白等分别在鱼

20、、鼠、猪、羊等转基因动物中得到了一定程度的表达。 2.外源基因表达（似乎）有一定组织细胞的特异性 实验证明，有些基因只在相应内源基因正常表达的正常细胞内表达，如免疫球蛋白的、基因，胰岛素基因等。某些基因只在一个细胞类型表达；某些基因可在一些细胞类型内表达；某些有可以在大多数细胞类型得到表达，但将在这三类基因转入小鼠又都可以得到适当的表达。 目前一些实验资料提供的线索和证据往往出现矛盾。,3.外源基因表达水平及其组织特异性的影响因素很多，从目前获得少数高效表达的转基因动物来看，这种高效表达及其组织特异性与： 外源基因的同域作用成分启动子（有时与增强子）有关及 相应组织细胞（宿主）提供的跨域作用成

21、分有关。 某些外源基因含有启动子/增强子，有利于外源基因的高效表达和 组织特异性的表达，但也有不表达的实验报告。 4.外源基因的整合位点是随机的，大多数不可能整合在核基因相应的原来位点上，但仍可表达，看来整合位点似乎不明显影响表达水平，这可能与受正常的调节因子诱导有关，如转铁蛋白基因可以受雌激素的诱导。,（六）转基因动物的生理、病理表现与遗传 1.生长状态和病理效应 哺乳类动物的生长受复杂的遗传和激素的控制。 如转基因鼠、猪或牛，外源的GH和GHRF（生长激素释放因子）结构基因表达，使相应多肽激素高水平产生，刺激动物加快生长，转基因小鼠的体重约为对照组的1倍（312周后）。 GH的异位产生使转

22、基因鼠生育力下降，出现成熟前老年化等生理病理效应，高水平的GH可反馈抑制内源GH的合成。 2.生殖与遗传 当外源基因以单一位点整合与生殖细胞时，一般可按孟德尔方式遗传，外源基因可以稳定传给其子代，但也转移基因发生重排、缺失或部分缺失的现象。 能否培育成功稳定的转基因动物属系，据转基因小鼠的培育和遗传情况，存在3个决定性因素： 外源基因导入以及整合至宿主染色体DNA的胚胎期 整合位点数 整合的具体位置。如果外源基因的DNA的整合发生于受精卵的单细胞期，则转基因的小鼠的所有细胞，包括体细胞和生殖细胞，都将含有导入的外源基因。,（七）转基因动物中外源DNA的检测 转基因动物的检测可在不同层次上进行。

23、 1. DNA水平 报告基因 如半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白的检测 目的基因 提取基因组DNA进行斑点杂交，Southern杂交和PCR分 析等。 2. 转录水平 Northern杂交、RTPCR及Rnase保护分析等。 3. 蛋白质水平 Western印迹分析。 以确定转基因动物是否整合了外源DNA及整合的拷 贝数。,附：制备基因组DNA 1.每离心管中加入200l饱和的NaCl（6mol/l）。 2.将离心管置于纸盒中剧烈晃动200次。 3.置于冰上10min。 4.温室1400rpm离心，10min。 5.将上清500 l转移至干净的1.5mi离心管中，每管加入0.8ml无水乙醇，混匀。 6

24、.1400rpmlixin，5min。 7.室温干燥，将DNA重悬于50 lTE中，37C保温至DNA完全溶解后可用于PCR或Southern杂交分析。 基因组DNA的PCR反应 1.放置反应混合液 基因DNA样品 1 l 5引物（20pmol/ l ） 1 l 3引物（20pmol/ l） 1 l 20mmol/l dNTP 0.125 l Taq聚合酶 0.125 l 10PCR反应缓冲液 2.5 l H2O 19.25 l 25 l PCR反应 50C 10min 94C 2min（94C 30s ，60C 30s，72C 2min） 72C 10min 30次循环,七、转基因动物的应用

25、和前景 （一）研究基因的结构与功能 基因的表达与调控，是生命的奥秘之所在。转基因动物基因的表达与调控提供了一个理想的实验体系。 1.转录复制调控的研究 转入不同的周围序转入小鼠受精卵，观察外源基因在不同时期胚胎细胞或个体中的表达，有助于找出复制和调控的元件。 2.组织表达特异性元件的寻找 不同组织体细胞DNA的组成相同，为什么有的基因开放，有的基因不开放，形成组织特异性，可用上述方法转基因研究组织表达特异性元件。 3.基因结构和功能关系的研究 4.基因表达调控研究 （二）建立动物模型 1.肿瘤转基因动物模型 将癌基因转入小鼠受精卵，建立肿瘤范文模型，为肿瘤治疗及抗癌药物筛选开辟了新途径。 2.

26、高血压转基因动物模型 3.动脉粥样硬化转基因动物模型 （三）基因治疗 （四）基因产品的制备,第二节 转基因植物 转基因植物（transgenic plant）：应用转基因技术培育成功的携带外源基因并能稳定遗传的植物就是转基因植物。 一、 基本方法 转基因植物的技术路线为： 1.选择及获得外源目的基因，将目的基因克隆到表达载体上： 2.受体细胞的培养，如培养愈伤组织，悬浮细胞，无菌属层； 3.选用适当的转基因方法将目的基因导入受体细胞，可用纯化的表达载体直接转化，也可用载体转化农杆菌，再一农杆菌转化受体细胞； 4.将转化细胞进行适当培养； 5.筛选阳性转化细胞； 6.培植阳性转化植株； 7.转基

27、因植株的鉴定。 二、 转基因植物在医学上的应用 1.生产药用蛋白。因为植物是真核生物，该蛋白利于人体消化，且成本低，产量高。 2.新的疫苗来源，特别适合作为口服疫苗。 3.产生单抗，作为肿瘤化疗药物。,第三节 基因打靶 基因打靶（gene targeting）： 是指通DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。 若定向敲除某个基因，称为基因敲除（gene knockout）； 若定向将一段基因序列代替另一段基因序列，则称为基因敲入（gene knockin）。 目前这种技术主要在小鼠胚胎干（ES）细胞中进行。,一、 基因打靶的必备条件 （一）ES细胞 1

28、.ES细胞： 是取自小鼠胚胎早期的内细胞团，即小鼠受精卵发育第4、5天的胚胎细胞。 2.ES细胞的特点： （1）能在体外培养，并保留发育的全能性。 （2）ES细胞体外贴壁的形态特征是：核大，胞浆少，细胞排列繁密，呈集落样生长。 ES细胞体外培养要解决的关键问题是：维持细胞的分裂增殖及正常的核型，同时抑制细胞的分化。 将ES细胞进行体外遗传操作后重新植回小鼠胚胎，可发育成胚胎的各种组织最后形成嵌合体小鼠（chimeric mouse）如果这种ES细胞能发育成小鼠的生殖细胞通过交配可得到基因敲除或敲入的小鼠。,（二）打靶载体 打靶载体含有两种筛选标志：neo阳性筛选标志；HSVtk阴性筛选标志。

29、1.neo阳性筛选标志： 将neo基因插入用于打靶的外源DNA中。当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生重组时neo基因也被插入到染色体因此发生同源重组的ES细胞能在含G418的培养基中生长。 2.HSVtk阴性标志： HSVtk是来源于单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）的胸腺嘧啶激酶基因，此基因产物可以分解单核苷酸类似物而产生毒性代谢产物。HSVtk插入外源基因外测的载体序列中。当外源DNA与染色体上的同源序列发生同源重组时载体部分（含HSVtk基因）是不能被整合到染色体中的。 如果细胞能在含单核苷酸类似物的培养基上生长，说明载体部分亦重组到染色体中；相反，如ES细胞

30、在此种培养基中被杀死，说明载体部分没有插入基因组。,二、基因敲除的基本程序 （一）打靶载体的构建 1.获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中； 2.从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端； 3.将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间； 4.在目的基因同源顺序的外测线性化重组质粒载体，将HSVtk基因克隆到此线性载体中。 这种内部分残留的待敲除基因的同源片段位于其内部的neo基因和位于其外测的HSVtk基因共同构成的载体即为打靶载体。,（二）打靶载体导入ES细胞 一般多采用显微注射法将打靶载体导入ES细胞。 通过打靶载体上目的基因的与染色体上的待敲除基因发生重组置换，以载体上的neo基因置换ES细胞基因组的目的基因从而得到了丧失目的基因的ES细胞（基因敲除细胞）。 （三）基因敲除ES细胞注入胚泡 将基因敲除ES细胞注入胚泡中，使其与原胚泡中的细胞共同组成胚泡内细胞团。,（四）胚泡植入假孕小鼠的子宫中 将含有基因敲