第十六章 色谱法概论

1、1,第16章 色谱分析法概论An Introduction to Chromatography,授讲人：黄红霞办公室：理工1号楼319室Tel: （0571）88204325 Mail: ,2,Show Time,俄国植物学家Tsweet,色谱法是一种能够把不同颜色混合物中的颜色分离出来的方法,3,内 容,发展概况 色谱法及分类 分离机制 色谱理论,4,1 色谱法发展概况,一、色谱法历史 Before 1930s：色素的分离 色谱法(Chromatography ）创始于20世纪初，俄国植物学家Tsweet 用于植物色素的分离 。,石油醚流动相 (mobile phase ，eluant, e

2、luent) CaCO3颗粒固定相（stationary phase） 相对运动,Chromatography 又称“层析法”,洗脱液,色素色带,洗脱液, 废水,5,1940s: 薄层色谱(TLC)和纸色谱法,纸色谱法,6,1950s: James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气相色谱法(GC) ，获得诺贝尔化学奖色谱法从单一的分离功能到分离 分析功能 以岛津GC为例,1956年，第一台GC-1A,2004年，GC-2014,50年35个型号,7,1960s: 高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱法（HPLC） 1980s: Jorgenson等集前人经验发展起来

3、的毛细管电泳(CE),8,优点：“三高”、“一快”、“一广”,局限性：,高选择性 高效能: 分析效率高 高灵敏度: 10-11-10-13g，适合痕量分析 分析速度快: 1-10分钟分析时间 应用范围广: 气体、液体、固体样品,二、色谱法特点,定性、定结构的特异性低，需要与其它的分析方法相结合（如GC-AAS，LC-MS）,分离和分析,9,三、色谱法现状和发展趋势,HPLC-MS,GC-IR,增强自动化，建立各种联用技术,用于复杂样品的分析，如中药分析或代谢组学,新型固定相和检测器，如UPLC，ELSD检测器，电雾式检测器和荧光检测器等,10,石油 陆婉珍院士,中山大学 酶填充,农药、食品和药

4、物安全,功能化材料,极端条件（航空航天，深海）,大连化物所卢佩章院士 张玉奎院士,南开大学 纳米材料,11,一、色谱法定义 是一种物理化学分析方法，利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。,固定相,固体,液体,流动相,液体,气体,2 色谱法及分类,12,二、分类,平面色谱法,纸色谱 薄层色谱（TLC） 高分子薄膜色谱,柱色谱法,填充柱色谱 毛细管柱色谱 开管柱色谱,1、操作形式,*柱色谱法: 固定相装于柱管内, 流动相在压力或重力作用下流动 *平面色谱法：固定相构成平面状层,流动相在

5、毛细管或重力作用下流动,13,2. 分离机制 (1) 吸附色谱: 被分离组分对固定相表面吸附中心的吸附能力 (2) 分配色谱 : 在固定相和流动相两相之间的分配系数差别 (3) 离子交换色谱:被分离组分离子交换能力 (4) 分子排阻色谱:被分离组分分子的线团尺寸或渗透系数大小,14,3. 两相分子聚集状态,15,4. 系统分类,Chromatogr.,GC,LC,Supercritical fluid chromatography (SFC),open tubular column chromatography,packed column chromatography,column chrom

6、atography,planar chromatography,counter-current chromatography,Classic LC,HPLC,TLC,PC,16,色谱的分离过程,如吸收色谱，组分在两相中的平衡过程： 吸附 解吸 再吸附 再解吸 反复洗脱 不同的分配系数 迁移率差 分离,四、基本术语,17,1. 色谱图：检测器输出的信号强度对洗脱时间作图所绘制的曲线 2. 色谱峰：组分流经检测器所产生的信号,（一）色谱和色谱峰,3. 基线（baseline）: 在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线. 稳定的基线应是一条平稳直线，反映仪器的噪声随时间的变化,基线漂移,18,4.

7、峰形参数： 对称因子（fs ）,fs 1.05，拖尾峰,fs 为0.95-1.05称为对称峰,W0.05h为0.05倍色谱峰高处的色谱峰宽,色谱峰三种形式：,19,（二）保留值,保留时间（ tR）：进样开始到某组分的色谱峰定点的时间间隔 死时间（t0或tm)：不被固定相吸附或溶解的组分(k=0）的保留时间。根据t0可求流动相平均流速,20,2. 保留体积, VR: 对称峰，组分1/2量被洗脱出色谱柱时消耗的流动相体积。与流动相流速无关,死体积,V0:柱中固定相颗粒间间隙的容积,调整保留体积, ：保留体积扣除死体积后的体积,调整保留时间， :组分在固定相中滞留的时间，是定性的基本条件,流速,注意

8、：VR是定值，tR与FC成反比,21,3. 相对保留值, r: 两组分的调整保留值之比, 也称分离因子，是色谱系统的分离选择性指标,4. 保留指数, I: Kovats 指数，气相色谱中的定性参数,注意：r与固定相和柱温相关，与柱径、柱长、流动相流速等无关,z与z+n为正构烷烃对的碳原子数 ，Z为6，7，8，I为600，700，800,22,（三） 色谱峰高, h和峰面积, A（定量分析指标） （四）色谱峰区域宽度 衡量柱效的重要参数之一,三种方法： 1.标准差 (standard deviation ; )：0.607倍峰高处的峰宽之半/半峰宽 2.半峰宽（W1/2）：W1/2=2.355

9、3.峰宽 (peak width; W): W=4 =1.699W1/2,区域宽度越小柱效越高,23,（五）分离度 (resolution，R),又称分辨率，是总分离效能指标，能真实反映组分在色谱柱中的分离情况 相邻两组分色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比,24,当 R=1.5，两峰完全分开(99.7%)，又称基线分离. R1.5 药物定量分析要求（中国药典2010版规定）.,25,四、分配系数和色谱分离,(一) 分配系数和保留因子 分配系数,（二）分配系数和保留因子与保留时间关系,两者关系,保留因子,v=L/tR,u=L/t0,tR=t0(1+ k) tR=t0(1+K ),26,注意

10、： 保留因子表示组分在色谱柱中多停留的时间与死体积的比值,K，tR K=0，组分无保留 K ，组分保留时间长,27,（三）色谱分离的前提,KAKB 或kAkB 是色谱分离的前提。,推导过程：,28,色谱图的意义： 色谱峰数样品中单组分的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。 和k是计算分离效能的重要参数！,29,（一）吸附色谱 （二）分配色谱 （三）离子交换色谱 （四）分子排阻色谱,3 分离机制,30,（一）吸附色谱,固定相吸附剂（硅胶or Al2O3）吸附活性中心 机制：见图 组分

11、分子与流动相分子争夺吸附中心,吸附系数,吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm,Note：Ka 与 组分的性质，活性剂的活性和流动相性质有关,柱色谱中,吸附色谱法,固定相 多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。 硅胶表面硅醇基为吸附中心。 经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶 高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅胶和堆积硅珠。 气相色谱：高分子多孔微球等,吸附色谱法,流动相 有机溶剂（硅胶为吸附剂） 洗脱能力：主要由其极性决定。 强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。 Snyder溶剂强度o：吸附自由能，表示洗脱能力。o值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。,

12、一些溶剂在硅胶上的o值,洗脱顺序 ka=KaSa/Vm 在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。 Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。,吸附色谱法,35,（二）分配色谱,固定相: 涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体 流动相: 气体或液体 机制：见图 与萃取类似,分配系数,Note：Ka 与 流动相性质，固定相极性和柱温有关,分配色谱法,固定相 又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。,流动相 气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。 液液分配色谱法

13、：与固定相不相溶的液体。 正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。 反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。,分配色谱法,洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。,正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。（库仑力和氢键力）。,反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。,38,（三）离子交换色谱,固定相：离子交换树脂和化学键合离子交换 流动相: 缓冲溶液 分析: 离子化合物(有机或无机离子) 机制 见图 离子交换能力差异,阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ RSO3-X+ + H+,阴离子交换树脂 RNR3+OH- + X- NR3+X- + OH-,39,选

14、择性系数与分配系数关系,离子交换通式,KA/B是离子对树脂亲和能力相对大小的度量，KA/B越大，A的交换能力大，越易保留。 常选择某种离子（如H+或Cl）作参考。 KA、 KB为A、B的分配系数。,离子交换色谱法,固定相 离子交换树脂: 有网状骨架及可离解、可交换基团，如磺酸基 (SO3H) 、羧基 (COOH) 及季胺基 (NR3+OH) 等。性能指标常用交联度、交换容量和粒度等。 化学键合离子交换剂：键合在薄壳型和全多孔微粒硅胶上。用于HPLC中的固定相 流动相一定pH和离子强度的缓冲溶液，有时也加入少量有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以提高选择性。,离子交换色谱法,影响保留行为的因素

15、被分离离子、离子交换剂、流动相的性质等 (1) 离子的电荷和水合半径：价态高选择性系数大。同价阳离子在酸性阳离子交换剂上,水合离子半径, 选择性系数小。 (2)离子交换剂的交联度和交换容量:一定的范围内树脂的交联度越大，交换容量越大，则组分保留时间越长。 (3)流动相的组成：交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能力。流动相的离子强度高，使组分的保留值降低。,42,（四）分子排阻色谱法,固定相: 多孔性凝胶 流动相: 水（凝胶过滤色谱)；有机溶剂(凝胶渗透色谱),又称空间排阻色谱或凝胶色谱法,机制 见图 分子大小或渗透系数大小差异,渗透系数,Note：Kp 与溶质分子的大小和凝胶孔径有关，与

16、流动相无关,（0Kp1 ）,空间排阻色谱法,流动相 要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低 水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱；GFC)； 非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相 (凝胶渗透色谱；GPC)。,空间排阻色谱法,保留体积与渗透系数的关系,VmV0,分子线团尺寸（分子量）大的组分，其渗透系数小，保留体积也小，因而先被洗脱出柱。,45,小结,色谱过程方程式：,分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。,K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp， Vs分别为

17、色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。,46,3 色谱理论,1.热力学理论塔板理论 由平衡的观点来研究分离过程，是一种半经验理论 2.动力学理论速率理论 从动力学观点，即速度来研究各种动力学因素对柱效的影响，以Van Deemter 方程式为代表,47,一、塔板理论,（一）基本假设,在一个塔板高度H内，组分可以在两相中瞬间达到分配平衡； 流动相非连续进入色谱柱，且每次进入一个塔板体积； 忽略样品沿柱方向的纵向扩散； 分配系数在各塔板上是常数。,（二）二项式分布,色谱过程与逆流萃取是相似的,在各塔板内组分符合二项式展开式：,如N=3,(ms+mm)N

18、,转移N次后，第r号塔板中的质量Nmr：,例：转移3次后，在第2号塔板内的溶质分数,49,2、两组分的分离,A(kA=1)和B(kB=0.5)两组分 （分布图）,结果： 组分B: k=0.5, 当N=6和7时，柱出口产生B的浓度最大点；组分A：k=1，N=8和9时，柱出口处达到浓度最大点。 两组分开始分离，k小的组分B在柱后先出现浓度极大值, 即先出柱。,组分A(kA=1)在n=5的色谱柱内和出口的分布 N r 0 1 2 3 4 柱出口 0 1 0 0 0 0 0 1 0.5 0.5 0 0 0 0 2 0.25 0.5 0.25 0 0 0 3 0.125 0.375 0.375 0.12

19、5 0 0 4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0 5 0.032 0.157 0.313 0.313 0.157 0.032 6 0.016 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079 7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118 8 0.004 0.032 0.111 0.220 0.274 0.137 9 0.002 0.018 0.072 0.166 0.247 0.137 10 0.001 0.010 0.045 0.094 0.207 0.124,52,k=1的组分从n=5色谱柱中的流出曲线图,N 柱出口 0

20、 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0.032 6 0.079 7 0.118 8 0.137 9 0.137 10 0.124,53,（三）流出曲线方程,讨论：,当塔板数很大时（n50），流出曲线趋于正态分布曲线。,t=tR时，C有极大值：,Cmax即流出曲线的峰高h。 一定时， 峰高h取决于C0。 C0一定时， 峰高h取决于。,流出曲线方程的常用形式：,不论ttR或ttR时，浓度C恒小于Cmax。 C随时间t向峰两侧对称下降。 越小，峰越锐。 是柱效的标志。,色谱峰面积,以A代替C0，h代替Cmax，且W1/2=2.355 ，,峰面积:,A = h(2)1/2,A=1.065W1/2

21、h,色谱定量的参数,56,（四）柱效,理论塔板高度（H）和理论板数（n）,n越大，柱效越高； 如果用 计算理论板数，所得值为有效理论板数neff,理论板数取决于 固定相种类、性质、填充状况和柱长； 流动相及其流速； 被测物性质等。,L一定，h与n呈反比，即H越小，柱效越高,Heff 有效板高,色谱柱效参数,57,例题,有效理论塔板数和有效理论塔板高度,Hef =L/nef,59,塔板理论的局限性,塔板理论在解释流出曲线的性状、浓度极大点的位置及评价色谱柱柱效等方面是成功的。但是 1）假设不现实，传质和纵向扩散被忽略。 2）不能说明影响塔板高度有哪些主要因素，即影响峰扩张的原因。 3）不能解释柱

22、效随流动相流速改变而不同的原因。 4）不能说明影响柱效有哪些主要因素。,60,二、速率理论,速率理论是把色谱过程看作一个动态过程，研究过程中的动力理学因素对峰展宽的影响。 HPLCGiddings方程式 GCVan Deemeter方程式,u为载气的线速度cm/s； A、B和C是影响峰扩张的三项因素。,H = A + B/u + Cu,塔板高度,涡流扩散项,纵向扩散项,传质阻抗项,61,Relationship between velocity and n,62,(一)影响H 的动力学因数1. 涡流扩散项,色谱柱填料粒径大小不等，填充不均匀，使同一个组分的分子经过多个不同长度的途径流出色谱柱,一些分子沿较短路径运行，较快通过色谱柱；而一些分子沿较长的路径运行，发生之后，结果色谱峰展宽,63,柱子填料粒子越小，涡流扩散系数越小 dp小， A小；但dp 太小， 和柱阻大。,填充柱60100目 开管柱（0.10.5mm），A=0，高柱效 如毛细管柱,64,(一)影响H 的