第六章转录转录后加工及逆转录

1、第六章 转录、转录后加工及逆转录,转录(transcription)：以DNA单链为模板，核苷三磷酸NTP（ATP,GTP,CTP,UTP四种核糖核苷三磷酸）为原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。,转录的条件：,第一节 转录的基本特征,转录、复制的异同点,转录通用公式：,模板,Nn,+,NTP,模板,Nn+1,+,PPi,Mg2+,RNA聚合酶,1.原料是NTP （ATP,GTP,CTP,UTP四种核糖核苷三磷酸）。 2.RNA聚合酶+ 镁。 3.起始链核苷酸为嘌呤核苷三磷酸，5端保持三磷酸集团。 4.DNA双链上，一股链可转录，另一股不转录。 5.有意义链与反意义链并非固定不变。

2、6.转录方向都是5 3,模板链： 反意义链 antisense strand：以该链中的DNA碱基顺序指导RNA的合成-被转录的那条 DNA 链。 编码链： 有意义链 sense strand / template strand ：不被转录的那条DNA链，但其碱基顺序除T用U代替外，其余与 mRNA相同 。,几个基本概念,5- GCAGTACATGTC -3编码链 DNA 3- CGTCATGTACAG-5模板链 5- - GCAGUACAUGUC-3 mRNA N -Ala-Val-His-Val-C 蛋白质,有两方面含义： 1）DNA分子双链上的某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不

3、转录； 2）模版链并非永远在同一单链上。,双链DNA分子上分布着很多基因，并不是所有基因的转录均在同一条DNA单链上，而是一些基因在这条单链转录，另一些基因的转录在另一条单链上，DNA双链一次只有一条链可作为模板转录，称之为不对称转录。,第二节 指导下的聚合酶,RNA 聚合酶 依赖DNA的RNA聚合酶（DNA -dependent RNA polymerase,DDRP ） 以DNA 为模板，催化 2个游离的 NTP形成 3，5-磷酸二酯键。,一、原核生物 RNA 聚合酶,1、大肠杆菌RNA聚合酶的组成,西格玛,全酶 (Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme),(1) 全酶（

4、Holo Enzyme） 用于转录的起始 依靠空间结构与DNA模板结合 专一性地与DNA序列(启动子)结合 转录效率低，速度缓慢（ 的结合 ）,（2） 核心酶 （Core Enzyme） 作用于转录的延伸过程 依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性 基团与DNA的磷酸根之 间） 非专一性的结合（与DNA的序列无关）,2、各亚基的特点和功能 （1） 因子 因子可重复使用 修饰RNApol构型 使Holo Enzyme 识别启动子的特定区域,2 ,2, 2 ,2,（3）全酶的组装过程, 不同的因子识别不同的启动子 E.coli 中有五种因子（70、32、54、28 、 24 ） 枯草杆菌中有1

5、1种因子 （因子的更替对转录起始的调控） （2）因子,核心酶的组建因子, 促使RNApol 与DNA模板链结合, 2 2, 前端因子使模板DNA双链变单链 尾端因子使单链DNA重新聚合为双链,（3） 因子, 促进RNApolNTP RNA elongation, 完成磷酸酯键的连接 Editing 功能（排斥与模板链不互补的碱基）,E site（RifR）:对NTP非专一性地结合,（4） 因子 参与RNA非模板链的结合 （充当SSB）, 构成Holoenzyme 后，因子含有两个位点 I site（Rifs）: 该位点专一性地结合ATP或者GTP,（利福霉素 rifamycin、利福平 rif

6、ampin）抑制I位点 （利迪链菌素（streptollydigin）抑制E位点,由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点,有义DNA链结合位点（ 亚基提供） DNA/RNA杂交链结合位点（亚基提供） 双链DNA解链位点（前端 亚基提供） 单链DNA重旋位点（后端亚基提供） 因子作用位点,1.请叙述端粒酶。79-81 2.真核生物与原核生物的DNA复制异同点。82-83 3.突变类型85 4.简述holliday模型步骤102-106 5.简述原核生物RNA聚合酶119-120 6.利福霉素和利福平/利迪链霉素作用于哪些因子，哪些位点。126,二、真核生物RNA聚合酶（三种）,敏感度是指浓

7、度抑制力： 高（10-910-8mol/L）， 中（10-510-4mol/L）， 低（大于10-3mol/L）。,一、真核生物的RNApol 1、 三种RNApol： 根据对 - 鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApol 最不敏感 （动、植、昆） RNApol 最敏感 RNApol 不同种类（物种）的敏感性不同 2、 位置和转录产物 RNApol 核仁 活性所占比例最大 转录rRNA（5.8S、18S、 28S）,RNApol 核质 主要负责 hnRNA、snRNA 的转录 hnRNA（mRNA 前体，核不均一RNA heterogeneous nuclear RNA） snRNA（核内小分

8、子 RNA small nulear RNA) RNApol 核质 负责 tRNA,3、亚基组成： 分子量500KDa,含两个大亚基和 712 个(4-8)小亚基 RNApol： 大亚基中有 C 末端结构域 (carboxy terminal domain CTD) CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复 TyrSerProThrSerProSer 酪氨酸-丝氨酸-脯氨酸-苏氨酸-丝氨酸-脯氨酸-丝氨酸 C 端重复七肽 不同生物中重复数目不一样（酶活性）, CTD中的丝氨酸和苏氨酸可被高度磷酸化 磷酸化的 RNApol 被称为A 非磷酸化的 RNApol 称为B CTD参与转录 B A 使 RN

9、Apol易于离开 启动子进入延伸过程（10倍）,二、 真核生物的启动子 三种 RNApol 识别三种启动子 三种聚合酶需要不同的转录因子-TF 、 TF 、TF 等 注：每种转录因子根据发现的先后再分为ABC (TF A TF B) 三种转录方式 三种产物： RNA聚合酶mRNA前体； RNA聚合酶rRNA； RNA聚合酶tRNA和 5S RNA,RNA 的转录包括 promotion. elongation. termination 三过程 从启动子 (promoter)到终止子(terminator)称为转录单 位 (transcription unit) 原核生物的转录单位多为操纵子op

10、eron 真核生物中的转录单位多无 operon 转录起点即转录原点记为1，其上游记为负值，下游 记为正值,一、原核生物启动子和终止子 启动子（promoter）:RNA聚合酶的结合区域。 启动子的特点: (1)在转录起始点的5端 (2)TTGACA:Sextama框，RNA聚合的识别部位（酶靠亚基与之结合），在-35区。 (3)TATAAT: Pribnow 框，RNA聚合酶的结合区，在-10区。,Pribnow 框 结合位点,Sextama框 识别位点,（1） Sextama 框（Sextama Box） RNA聚合酶的松弛结合（只为识别）， RNA聚合酶依靠其亚基识别该位点 决定了启动子

11、的强度 不同启动子中位置略有变动,（2） Pribonow 框（Pribonow Box） RNA聚合酶的牢固结合位点 一致序列：TATAAT,4、RNApol 在DNA上结合位点的鉴定 足迹法（footprinting） 足迹法原理： 限制酶切割结合有RNApol的DNA 末端标记该DNA 用内切酶降解DNA 凝胶电泳分离，放射自显影观察,大片段DNA,末端标记大分子DNA,重新结合RNApol,作对照 直接用DNase 进行降解,电泳,用微量DNase降解,电泳,原核生物的终止子,终止子：提供转录终止信号的一段 DNA 序列。 两个主要结构特征： 1.反向核苷酸重复序列：5-CGGATG|

12、CATCCG-3 反向序列的长度和GC含量直接影响RNA二级结构的稳定性（分子内碱基配对促成了RNA二级结构） 2.紧接反向重复序列的连续寡聚U,2. 原核生物的终止子一个回文结构（颈环式的发荚结构）。 可分为两种： 不依赖于的终止子：有寡聚 U 序列，回文对称区富含 GC序列。 依赖的终止子：无寡聚 U 序列，回文对称区不含GC。 因子-终止因子:是 55KD 的蛋白质，可水解三磷酸核苷，协助RNA聚合酶识别终止子的辅助因子。 例:大肠杆菌色氨酸操纵子-尾-40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区-转录终止子的结构。,二、真核生物启动子 真核生物中有三种不同的RNA聚合酶，因此也有三种不同的

13、启动子，其中以启动子最为复杂。 （1）有多种元件：TATA框/盒，GC框，CAAT框，OCT等； （2）结构不恒定； （3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同； （4）有的有远距离的调控元件； （5）元件起到控制转录效率和选择起始位点的作用； （6）转录时先和其它转录激活因子结合，再和聚合酶结合。,增强子,-200,核心启动子元件：单独发挥作用可确定转录起始点+产生基本水平转录 （1）TATA框：顺序TATAATAAT。在转录起始点上游约-25-30bp处，基本上由A-T碱基对组成，为RNA聚合酶的结合处之一，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能开始转录，RNA聚合酶转录所需最小的D

14、NA序列。 上游启动子元件：控制转录频率，不参与起始位点的确定。 （2）CAAT框：顺序GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区，位于转录起始点上游约-80-100bp处，也是RNA聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。 （3）GC框：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由GGCGGG组成，是一个转录调节区，有激活转录的功能。,真核生物的RNApol 1、 三种RNApol： 根据对 - 鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApol 最不敏感 （动、植、昆） RNApol 最敏感 RNApol 不同种类（物种）的敏感性不同 2、 位置和转录产物 RNApol 核仁 活性所占比例最大 转录

15、rRNA（5.8S、18S、 28S）,RNApol 核质 主要负责 hnRNA、snRNA 的转录 hnRNA（mRNA 前体，核不均一RNA） snRNA（核内小分子 RNA) RNApol 核质 负责 tRNA、5S rRNA和部分 snRNA,1、 RNApol的启动子 结构最复杂 位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成 通用型启动子（无组织特异性） （1） 帽子位点 （2） TATA框 定位转录起始点的功能 （类似原核的Pribnow框） TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的,（3） CAAT框（CAAT box） 位于75bp处, 一致序列为GGC/TCAATCT 前两

16、个 G 的作用十分重要(转录效率) 增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性 以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在,（4） 增强子（enhancer）： 研究SV40病毒时发现，启动子上游的某些序列若发生变化，则大大降低转录活性，这些序列对转录起增强作用，故称增强子。 一段能够加速基因转录的调节性序列，通过改变DNA模板的螺旋结构和顺势调控RNA聚合酶及特异性蛋白。 效率高：是转录频率增加10-200倍。 特点：1.位置不定（5端上游，3端下游，甚至于内含子中） 2.序列长，有芯(TGGA/TA/TA/T) 3.作用距离远。（延至数千碱基） 4.作用无论正反（倒置依然起作用） 5.发挥

17、作用需要叠加（启动子+增强子） 6.需要特定因子才能发挥作用。,（5） GC框 （GC box） 位于90附近，较常见的成分 核心序列为GGGCGG 可有多个拷贝，也可以正反两方向排列,小结： 不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同 不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交 启动子功能没有变化 各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上， 组成起始复合物，蛋白因子间的相互作用决定 了转录的起始,3、 RNApol I启动子结构,主要由两部分组成 目前了解较清楚的是人的RNA聚合酶I的启动子 核心启动子（core promoter）位于45至+20的区域内，这段序列就足以使转录起始。 上游调控

18、元件（upstream control element, UCE） ，从180至107，提高核心启动子的转录起始效率。 两个区域内的碱基组成和一般的启动子结构有所差异，均富含GC对，两者有85%的同源性。,终止子：位于基因的3端，是终止因子因子识别结合处，阻断转录的进行 。,三、原核生物、真核生物转录起始位点的结构差异,1、原核生物mRNA起始位点没有“帽子”结构，嘌呤和嘧啶都能起始转录；真核基因转录的起始位点具有“帽子”结构，且只有嘌呤才能起始转录。 2、原核基因启动区范围小；真核基因调控区较大。 3、除Pribnow框之外，原核基因启动子上游只有TTGACA区作为RNA聚合酶的结合位点；真

19、核基因除了框之外，还拥有GC区和增强子等。,一、转录-启动,1.RNA聚合酶正确识别DNA模板上的启动子。 2.DNA和核苷三磷酸（NTP）构成三元起始复合物启动转录。 原核生物：DNA模板上的启动区域有TATAATG顺序，Pribnow盒。复合物中的核苷三磷酸一般为GTP。 真核生物： DNA上的转录启动区域有TATA盒。 第一个核苷三磷酸与第二个核苷三磷酸缩合生成3-5磷酸二酯键后，则启动阶段结束，进入延伸阶段。,DNA结合,全酶,DNA熔解,亚基脱落,延伸开始,三元复合物,第一个磷酸二酯键形成,封闭启动子复合物,开放启动子复合物,（1）RNA聚合酶I的转录起始,需要两种转录因子： 1.上

20、游结合因子（UBF） 2.选择因子1（SL1）由4种蛋白质组成，包括TATA框结合蛋白（TBP） UBF：特异地识别核心启动子和上游调控元件中富含GC的区域。 SL1：单独并没有识别特异DNA序列的功能。 注： 在UBF和DNA结合后，SL1才可结合上来。 只有当两种辅助因子与DNA结合后，RNA聚合酶I才能与核心启动子结合，从而起始转录。,RNApol ,（2）RNA聚合酶II 的转录起始： 作用于TATA框的转录因子至少有 7种，即TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、和TFIIJ。 TFIID：TBP TAF :TBP相关因子,RNA 聚合酶 催化的转录

21、起始,RNA 聚合酶催化各种前体 mRNA 的合成 需要TF 参与：TFA-J RNA 聚合酶 +TF 识别起始位点 ,开始转录, RNApol 的转录起始 两种内部启动子的转录起始需要三种辅助因子 TFA 一种含锌指结构的蛋白 TFB 由TBP和另外两种蛋白组成 TFC 5个亚基 TFB和TFC是RNApol 共同需要的转录因子, TBP 的作用 三种RNApol 的转录起始均需要TBP RNApol 的辅助因子TFB的组成需要TBP 在 RNApol的转录起始中,TBP是SL1的组份，起定位 RNApol的作用 RNApol的转录起始由TBP识别TATA框 TBP 起定位作用,所以又称定位

22、因子（positioning factor）,二、延伸,以原核生物的RNA连延伸过程为代表 亚基脱离酶分子：核心酶与DNA的结合变松较容易继续前移。 核心酶无专一性，能转录模板上的任何序列，包括在转录后加工时待切除的居间序列。 脱离核心酶的亚基可与另外的核心酶结合，参与另一转录过程。 随着转录不断延伸，DNA双链顺次地被打开，并接受新来的碱基配对，合成新的磷酸二酯键后，核心酶向前移去，使用过的模板重新关闭，恢复原来的双链结构。 一般合成的RNA链对DNA模板具有高度的忠实性。 RNA合成的速度，原核为2550个核苷酸/秒，真核为45100个核苷酸/秒。,（1）RNA聚合酶（核心酶） 与DNA模

23、板紧密结合，沿3-5方向移动 解旋作用：DNA解开17 bp 聚合功能 （2）杂交螺旋 RNA-DNA形成12bp长的杂交螺旋 转录产物RNA沿5-3方向延长 RNA延长速度：50个核苷酸/秒,三、终止,终止：包括停止延伸+释放RNA聚合酶及合成的RNA。 原核生物基因或操纵子的末端通常有一段终止序列即终 止子。 真核生物DNA上也有转录终止的信号。转录单元的3端均富有AT序列，在相隔030bp之后又出现TTTT 顺序（通常是35个T），这些结构与转录终止相关。,终止的方式,转录产物的后加工,1.mRNA前体的后加工 原核mRNA的原始转录产物都可直接用于翻译； 而真核mRNA一般都有相应的前

24、体，前体必须经过后加工才能用于转译蛋白质。 真核mRNA的原始转录产物- hn RNA/核不均一RNA-最终被加工成成熟的mRNA。,后加工包括四方面： 戴帽：装上5端帽子，转录产物的5端核苷酸的2为羟基被甲基化，装上甲基化的帽子。 hnRNA 5端开始的第一个核苷酸上+一个三磷酸鸟嘌呤 由腺苷蛋氨酸供甲基 在鸟嘌呤7位上甲基化 7-甲基鸟嘌呤三磷酸（m7G） 连在其后的第一个核苷酸2 位被甲基化（型帽子结构） ，若第二个也被甲基化（型帽子结构）。 Cap的重要性：为核糖体识别mRNA提供信号；可增加mRNA稳定性，保护其在转运时免遭核酸酶水解。,装上3端多聚腺苷酸尾巴： 在hnRNA的3端，

25、由多聚腺苷酸聚合酶催化的作用下，加上一段100-200个腺苷酸构成的多聚A尾巴。 具体功用未明，可能与mRNA从核内到细胞质相关，也可能与翻译的效率相关，与稳定mRNA结构有关。,剪接： 将hnRNA中的内含子切除，将外显子拼接。 内含子参与转录但不表达，实验证明其参与基因表达调控，转录后RNA的分子量比成熟mRNA大几倍或几十倍，因此需要切除内含子，连接外显子。,注： 有的真核mRNA前体，由于后加工的不同可产生两种或两种以上的mRNA（如人的降血钙素基因转录产物），因而能翻译成两种或两种以上的多肽链。,2.tRNA前体的后加工 tRNA前体有两类： 单个tRNA前体，在5和3端各有一段多余

26、顺序； 含二个tRNA的前体，除5和3端有长短不一的多余顺序外，在两个tRNA之间还有数目不等的核苷酸隔开。 真核生物tRNA前体后加工的相似步骤： 修饰：对tRNA分子上的部分核苷酸进行修饰（包括甲基化、酰化、硫代和重排等）； tRNA前体的剪接，切除5端的先导序列； 添加或修复3端CCA序列。,1.修饰：化学修饰 1）甲基化反应使嘌呤生成甲基嘌呤； 2）通过还原反应使尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶； 3）通过核苷内的转位反应使尿嘧啶转变为假尿嘧啶 2. tRNA前体的剪接，切除5端的先导序列 通过剪接去除tRNA前体的内含子或5端的先导序列 需要核酸内切酶和连接酶共同作用 核酸内切酶将内含子从pr

27、i-tRNA上切下pri-tRNA被分成5端半分子和3端半分子连接酶消耗ATP将两个半分子连接成成熟的tRNA.,rRNA 转录后的加工,核酶 - 真核生物 rRNA 的自身剪切,1982年切赫发现，在四膜虫rRNA前体中，去除含有413个核苷酸的居间顺序是由rRNA前体自身催化完成的。在 5-鸟苷酸的促进下经过自身催化作用将居间顺序切除，居间顺序前后的两个部分再连接起来，产生成熟的rRNA。 rRNA前体的自身催化作用表明 RNA具有类似于酶的活性。 这一发现突破了生物高分子中只有蛋白质才有催化作用的观念，对生物进化与生命起源等研究都将有重要的意义。,4、RNA 编辑（ RNA editin

28、g ）,一种与 RNA 加帽、加尾、剪接 不同的 RNA加工形式。 转录后改变 RNA 的序列 ，使成熟 RNA 的序列与基因组 DNA 序列不同。 生物学中心法则的补充，扩大了 mRNA 遗 传信息容量。,真核生物RNA的转录与原核生物的过程在总体上相同，也有几点不同： 真核生物RNA的转录是在细胞核内进行的，而蛋白质的合成则是在细胞质内进行的。（RNA转录后首先必须从核到质，才能指导蛋白质的合成） 真核生物一个mRNA分子一般只含有一个基因，原核生物的一个mRNA分子通常含有多个基因。, 真核生物RNA聚合酶较多， RNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA聚合酶三种不同酶，分别催化不同种类型RN

29、A的合成；在原核生物中只有一种RNA聚合酶，催化所有RNA的合成。 RNA聚合酶存在于细胞核，催化合成rRNA的合成； RNA聚合酶催化合成mRNA前体的合成； RNA聚合酶催化tRNA和小核RNA的合成。 真核生物RNA聚合酶不能独立转录RNA 。 在真核生物中，三种RNA聚合酶都必须在蛋白质转录因子的协助下才能进行RNA的转录。RNA聚合酶对转录启动子的识别，也比原核生物更加复杂，如对RNA聚合酶来说，有三个DNA的保守序列与其转录的起始有关，TATA框（TATA box）；CCAAT框（CCAAT box）；增强子（enhancer）。,转录的调节控制,转录的调节控制是基因表达调节控制中的一个重要环节：促进基因转录叫正调节；抑制基因转录叫负调节。 在原核生物方面1961年F.雅各布和J.莫诺提出的操纵子学说。调控方式为：诱导和阻遏作用；环腺苷酸和降解物活化蛋白的调节作用；弱化作用