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文档简介

1、蔗糖酶米氏常数的测定,【目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，学习求蔗糖酶米氏常数的方法 【原理】：米氏方程式 v = VmaxS Km +S 式中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数。 米氏常数的求法很多，最常用的是LineweaVerBurk的作图法(双倒数作图法)。 将米氏方程式改写为下列倒数形式： 1V=KmVmax1S+1Vmax 实验时，选择不同的s，测定相应的v，求出两者的倒数，以1/s为横坐标，以1/吉为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为-1/Km。,【仪器与试剂】 1. 仪器：分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒表、坐标纸 2试剂 标准葡萄糖溶液（

2、1mg/ml）、 0.2 molL蔗糖溶液、 0.2 molL NaAc缓冲溶液(pH4.6)、 .1molL NaOH溶液 3，5一二硝基水杨酸试剂。,【操作步骤】 1葡萄糖标准曲线的制定,将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25ml，摇匀。测540nm处A值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标准曲线。,取试管8支，按18编号,按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入8支试管中，于37水浴中保温10min。 取一定量酶液，放入同一水浴中保温约10min。 于各管中依次按同样时间间隔(0.5min或1min)加人已保温过的酶液1.0mL，计时，立即摇匀，在37水浴中作用5min。 按同样次序和时间间隔，加入5mL 1molL NaOH，摇匀，终止反应。 吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和1.0mL水的试管中，都放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/S为横坐标，1

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