光动力学诊断和荧光寿命成像显微学技术-2013.pptx

1、光动力学诊断（PDT) 荧光寿命成像显微学技术(FLIM)固体超荧光,2013年10月 丁才蓉,基本概念 光动力学诊断的光物理机制 双光子吸收截面实验测量方法概述,光动力学诊断（PDT）,光动力学诊断（Photodynamic Therapy，PDT）用特征波长光照射吸附有光敏药物的靶向肿瘤点，光敏药物产生三线态的氧，利用非自由基氧化过程杀死癌症细胞的诊断方法。最初使用是在1907年。（1） PDT 是一个冷光化学过程。光敏药物有低生物毒性，对器官损坏小，在处理某些恶性和良性的肿瘤有很大优势。（2）图1： PDT 的示意图,一、基本概念,根据鸿特规则，三线态能级比相应的单线态能量低,5,分子中

2、电子的能量状态,电子能级,振动能级,转动能级,电子的多重态,J=2S+1,S：为各电子自旋量子 数的代数和,S=0, J=1 单线态S表示,（所有电子都是自旋配对的）,S=1, J=3,三线态 T表示,大多数基态分子都处于单线态,电子在跃迁过程中伴随着 自旋方向的变化（自旋平行）,单线态和三线态,分子吸收和发射能量转移示意图,荧光：当物质分子吸收了特征频率的光子，由基态能级跃迁至电子激发态的各个不同振动能级。激发态分子经与周围分子撞击而消耗了部分能量，迅速下降至第一电子激发态的最低振动能级，并停留约109秒之后，直接以光的形式释放出多余的能量，下降至电子基态的各个不同振动能级，此时所发射的光即

3、是荧光。,产生荧光的第一个必要条件是：该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构； 第二个条件是：该分子必须具有一定程度的荧光效率，即荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光的量子数的比值。,大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所以大多数分子在基态时处于单线态。 当分子受光照射时，若光子能量恰好等于分子的某两个能级的能量之差，则分子吸收光子并从基态跃迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能级。但其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单线态。持续一段时间后，激发态电子的自旋可能倒转，生成三线态。 电子由S0进入T1的可能过程（

4、 S0 T1禁阻跃迁）： S0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1,E= Ee + Ev + Er,在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有原子核间相对位移引起的振动和转动。这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能级。在每一电子能级上有许多间距较小的振动能级，在每一振动能级上又有许多更小的转动能级。,分子能级,当一束频率为强度为I0的电磁波照射到某物质或某溶液时，组成该物质的分子、原子或离子等粒子与光子作用，光子的能量发生转移 ，I0 = Ia + It + Ir使这些粒子由低能量轨道跃迁到高能量轨道，即由基态转变为激发态。,分子的较高能级与较低能级之差E恰好等于该电磁波的能量 h

5、时，即有 E = h （ h为普朗克常数）,物质对光的选择性吸收,不同物质的基态和激发态的能量差不同，选择吸收光子的 能量也不同，即吸收波长不同。 用紫外可见近红外光谱方法、荧光光谱方法研究伴随有振动和转动能级的电子能级差特征。 红外光谱方法和拉曼光谱方法研究振动和转动能级差特征,量子跃迁中的选择定则,入射光为单色偏振光： L=1， m=0 入射光为单色非偏振光：可以得到电偶极跃迁的选择定则是L=1, m=0，1 多电子原子电偶极辐射跃迁选择定则，L=0，1。 选择定则的跃迁是否禁戒的判别规则可归结为：多电子原子中对于由两个或两个以上的非S态电子组成的电子组态，则在其所形成的原子态间L=0，L

6、=0的跃迁是可能的，而在此外的一切情形中的跃迁都是禁戒的。,光动力学诊断PDT过程能量转移示意图,Marina K. Kuimova1, NATURE CHEMISTRY | VOL 1 | APRIL 2009, page 69,系间跨越,振动弛豫,图（2）PDT对癌症作用机理示意图,Nature clinic practice urology, 6(1), 18-30 (2009),二、光动力学诊断的光物理机制,荧光原理示意图,波长选择:,不同的光敏剂吸收不同波长的光，受到激发，跃迁到高能量的激发单线态。 具有大的三阶非线性效应（大的极化系数）和大的吸收横截面的共轭型有机分子，吸收红外光双

7、光子，激发光敏剂比吸收可见光单光子激发光敏剂更有利于PDT。,Nature Photonics 2,394 (2008),（1）红外光较可见光有较少散射，能渗透到深的组织内部 （2）高的空间选择性，根据非线性吸收特点，光敏剂只有在高光子密度处的透镜聚焦的焦点处才有强的吸收 （3）红外光能量低，对细胞的损伤小 （4）活成具有大的吸收横切面且具有双光子活化特性的光敏剂是一个挑战。,双光子激发光敏剂：,双光子吸收基本原理,当具有频率为1和2的两 束光（也可以为同一频率）入 射到非线性介质后，如果两个 光子能量之和与介质的某个跃 迁频率相等或接近，入射光电 场会被吸收，两束光都被衰减。这种介质同时吸收

8、两个光子而引起两束光的衰减（从每一束光波中各吸收一个光子）的情况被称为双光子吸收。双光子吸收属于三阶非线性光学过程。,双光子吸收的三阶非线性耦合波方程,Weber M J(ed.). CRC Handbook of laser science and technology, Vol III. Florida: USA, CRC press, 1986. pp. 3-22. 过巳吉主编. 非线性光学. 陕西：西北电讯工程学院出版社，1986年. pp.224-225.,光敏剂必须满足的条件：,（1）必须带有特殊片段，满足和靶向细胞具有良好的亲合性； （2）大的双光子吸收截面； （3）荧光信号不会

9、被环境干扰，有足够长的寿命； （4）光敏剂不能干扰细胞和它的性质。 （5）光敏剂不发生化学变化，没有被消耗。,围绕光敏剂开展的研究,（1）首先确定材料的是否具有双光子吸收特性（无二阶非线性效应存在，即无和频、倍频、差频存在），也就是研究超短激光脉冲光经过光敏剂后透射光强在传播方向上的变化是否满足双光子吸收的耦合波方程； （2）其次研究合成具有大的双光子吸收截面的光敏剂，决定光敏剂的双光子吸收效率； （3）再次是研究光敏剂的荧光寿命，光敏剂三线态的寿命足够长有利于和氧分子发生作用，产生有活性的单线态的氧，杀死病毒细胞。,双光子吸收截面及其测量,双光子吸收截面定义：,C为溶液分子数密度，为超短脉冲

10、频率,三、双光子吸收截面实验测量方法概述,双光子吸收截面是双光子材料的重要光物理特性。目前，用于测量有机材料双光子吸收截面的实验手段主要有如下四种： 双光子诱导荧光法5-6， 非线性透过率测试方法7-8， 瞬态吸收光谱方法9-10 Z扫描法11-12,双光子诱导荧光法,双光子吸收诱导荧光发射信号强度的表达式：,在同样的实验装置和同样的实验条件下，使用已知双光子吸收截面的材料作为参考物，可以通过比较荧光信号强度，获得待测物的双光子吸收截面：,在实际测量中，通常近似认为单光子荧光和双光子吸收诱导荧光的量子产率相同，因此，通过测量待测物和参考物溶液的单光子荧光量子产率，并在相同的实验装置下，测量溶液

11、的双光子诱导荧光信号强度。,双光子诱导荧光法实验光路,（Xuchun Wang,Xiaohe Tian,Qiong Zhang,Pingping Sun,Jieying Wu,Hongping Zhou,Baokang Jin,Jiaxiang Yang,Shengyi Zhang,Chuankui Wang,Xutang Tao, Assembly, Two-Photon Absorption, and Bioimaging of Living Cells of A Cuprous Cluster，Chem. Mater. 2012, 24, 954961）,非线性透过率测试方法,非线性透过

12、率测试方法测试样品的透射光强随入射光强的变化，然后通过拟合非线性透射率的实验曲线，获得化合物的频率依赖非线性吸收系数，最后利用双光子吸收截面与非线性吸收系数的关系求得化合物的双光子吸收截面,光强在与传播方向垂直的平面上高斯分布满足方程：,非线性介质的透过率可表为,双光子吸收诱导的透射光强I(Z)为：,对于均匀有机溶液样品，通过实验测试透射光强随入射光强的改变，拟合实验数据，可以得出样品的双光子吸收系数。 分子的双光子吸收截面与双光子吸收系数的关系为：,注意： （1）避免所测样品或者实验元件中对入射光产生的一些反射，折射。 （2）样品中的其他非线性效应对透射光强的影响也会使测量结果有失准确。,瞬

13、态激发态吸收光谱方法（一）,优点：瞬态吸收谱方法适用于准确测量各种类型有机分子、尤其是弱荧光或无荧光发射分子的双光子吸收截面。,原理：实验在强泵浦光作用前提下进行，泵浦光使该介质分子发生双光子吸收跃迁到激发态；通过探测处于激发态的分子对弱探测光的单光子吸收获得分子的瞬态吸收光谱。,双光子吸收截面可以通过下式计算,泵浦-探测实验光路,不同波长探测光,Kevin D. Beleld， J. Phys. Chem. C 2012, 116, 1126111271,将激光器出射的激光分成能量比为 1:1 的两束，其中一束作为泵浦光聚焦于样品中；另一束经过可调节的光延迟后再聚焦于合适介质（宝石片），产生

14、超连续白光。将超连续白光分成能量比为1:1的两束，分别用作探测光和参考光。探测光也聚焦于样品中并在聚焦区完全被泵浦光覆盖。参考光进入盛有相同样品的参考池。从样品池和参考池透射出来的探测光和参考光聚焦于同一多色仪狭逢的不同点，利用CCD (Charge Coupled Devices) 记录多色仪输出的探测光和参考光的光谱。通过计算探测光相对于参考光的光强变化，可以获得样品的瞬态吸收谱。,瞬态激发态吸收光谱方法（二）,Z扫描方法,实验中，待测样品沿着光传播的方向，从-Z往+Z方向移动，用能量计录下样品处于不同位置时的透射光强，从而得到归一化光强透过率和Z轴位置之间的关系曲线，对测得的实验数据进行

15、数值拟合，就可得到双光子吸收系数，利用下述方程求得双光子吸收截面值。,q0(z,t)=I0(t)Leff/(1+z2/z02),Z扫描方法实验光路：,Z-扫描技术测量双光子的吸收截面依据的原理从本质上来说也是入射光经过非线性吸收介质以后的透过率，并且Z-扫描技术测量所得到的数值实际上是介质的非线性吸收系数。因此，它与非线性透过率法存在着相似的缺点。,例子,Phys.Chem.Chem.Phys., 2009, 11, 51195123 | 5119,荧光上转换的过程是一个三阶非线性过程，在这里通过双光子吸收完成。,荧光寿命成像显微技术,基本概念 荧光寿命 荧光寿命成像显微技术方法,荧光是分子吸

16、收能量后其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的 辐射复合发出的光。 荧光寿命是指分子在发射一个光子前在单线激发态所平均停留的时间。,影响荧光寿命的因素：荧光物质的结构；所处微环境的极性、温度、粘度，键合离子等条件有关,一、基本概念,荧光强度成像广泛用于研究细胞结构和荧光物质在活细胞中的吸附位置，然而荧光强度的变化依赖于实验条件，很难定量给出荧光强度。,荧光寿命是荧光物质的固有性质，与浓度，光漂白和激发强度无关，依赖于围绕荧光物质的离子和局部环境，比如蛋白质的束缚等。,荧光寿命成像可以区分荧光物质浓度和淬灭效应的影响。这使得荧光寿命成像显微学成为一个有力的工具进行细胞内

17、的定量环境和分子动力学分析。,荧光寿命：通过时间分辨光谱方法进行研究,1、相干时间分辨光谱学方法 以量子系统的波函数的相位驰豫为基础(泵浦-探测技术)，广泛应用于研究材料激发态的吸收、漂白和受激发射、电子散射及电子-声子相互作用等动力学过程。 2、非相干时间分辨光谱方法 分子电子能级之间的跃迁引起辐射发光，电子-空穴对复合发光，用非相干时间分辨光谱方法研究荧光衰减寿命。,简单的，激发态布居n随时间的变化由以下方程来描述：,叫做激发态的寿命，实际上， 代表发光中心处于激发态的平均寿命,如每个跃迁都有光子发射出来，发光强度I则处决于单位时间内处于激发态的中心数目的减少，即,发光衰减的规律是指数式的

18、，它的寿命代表发光强度降至起始强度的1/e所需的时间。,非相干时间分辨光谱方法,工作原理:,条纹相机把荧光中的时间信息转化为空间信息的装置。典型的条纹相机由条纹管、快速扫描电极、输入和输出装置。条纹相机主要是用来测量超快荧光。由超短光脉冲诱导的、从样品发出的荧光被聚焦在条纹相机的光阴电极上，从光阴电极上释放的光电子流量与聚焦在光阴电极上的荧光强度成比，这些电子在加速电场中被加速，然后在偏转电场中被偏离，最后入射到荧光屏的磷光粉上。因此，在不同的时刻，从光阴电极上释放出来的光电子入射到荧光屏上位置也不同。这样在荧光屏上就可以看到一条条轨迹或者称之为条纹，这些条纹的空间分辨率直接对应于荧光的时间分

19、辨率。类型细分为飞秒条纹相机，大动态范围条纹相机，帧条纹相机，X-射线条纹相机等。,条纹相机方法测量荧光寿命,Vt=v0-kt,时间分辨光致发光超快速激光光谱示意图,APPLIED PHYSICS LETTERS 90, 241918(2007),Time-resolved PL spectra of spontaneous emissions from ZnO, ZnO:Al, Zn0.88Mg0.12O lms at excitation densities of 0.110, 1.06, 0.377, and 0.471 J /cm2 respectively, and the temp

20、oral behavior of stimulated emissions (solid line),Decay times of a single exciton state in the s shell (solid line) and in the p shell (dash line), and decay time of multiexciton states in the p shell (dot line),PHYSICAL REVIEW B 71, 085304 (2005),荧光寿命成像显微技术方法(FLIM),荧光寿命的测量方法,时间相关的单光子计数方法(TCSPC, Ti

21、me Correlated Single Photon Counting ) FLIM 系统(时域方法) 快速 FLIM 系统 (频域方法),蕴含在这两种方法的基本物理学相同，都是基于有限的傅里叶变换，但荧光寿命成像显微学的数据采集和分析不同。,(TCSPC) FLIM 系统(时域方法),时域法是用同步到高速检测器的超短光脉冲激发样品 ,然后测量样品在受到光激发后不同时刻所发出的荧光的强度 ,最后根据荧光强度的衰减规律来分析并计算荧光寿命值。,用于荧光寿命值比较长的测量,TCSPC是弱光探测仪器, 能有效的避免收集光学损失,探测器灵敏度的限制,强光激发下的光学漂白.,TCSPC时域方法的原理,

22、周期光激发下,在多个周期循环中采集数据, 从多个循环中收集的单光子过程中重构单周期的光子的衰减曲线。 基于单光子的周期循环记录,线性依赖于循环次数。 探测器PMT或者MCP或者SPAD，每个周期只收集到一个光子。 在每个时间段内收集的单光子的柱状代表了时间衰减。 必要时必须衰减光量以满足单光子要求。,时域法FLIM数据采集与分析,发光遵守指数式的衰减规律：,荧光动力学过程一般以多指数函数形式进行描述：,测试到的衰减轨迹是本征荧光衰减曲线F(t)和仪器响应函数R(t)的卷积,多个循环周期,荧光寿命柱状图-指数衰减,收集到单光子和空循环的过程是随机发生的，只能用几率描述。,单光子记录的实验方法：,

23、时域法FLIM系统装置示意图：,时域法FLIM实验结果,快速 FLIM 系统 (频域方法),在频域法中 ,用正弦波调制激光激发样品 ,荧光的强度也是按正弦调制的 ,根据二者调制频率不同（零差法和外差法） ,通过测量荧光相对于激发光的相移及解调系数来计算荧光寿命值。,对于不 同的实验样品可选择不同的调制频率（ MHz 相对于nS衰减），从而可扩大荧光寿命的测量范围。,固体超荧光,固体超荧光则是量子调控领域内一种全新的自发性宏观量子相干现象。,合作辐射是大量具有初始宏观偶极矩的相干态的相干辐射或者大量具有初始相干性的激发原子的相干辐射。包括激射、超辐射和超荧光。,在三能级和四能级系统中，处于布居翻

24、转的大量激发态会在很短时间内跃迁回到基态，在实验上经常被观测到激射过程。,64,Introduction,What is Superfluorescence (SF) ?,-L. O. Schwan, J. Lumin., 48 Spontaneous coherence: disorder to order, quantum self-assembly; Intrinsically quantum mechanical, decay is triggered by a single random spontaneous emission due to quantum fluctuation;

25、 Macroscopic quantum fluctuations in the time domain; The EM interaction mechanism leading to spontaneous coherence is not very clear; Full quantum theory for SF has not been well developed ; Connection to Bose-Einstein Condensation (BEC); ,71,Features of SF, against ASE Dephasing time (T2 or T2*),

26、the inverse of dephasing rate; T2, inverse of linewidth of homogeneous broadening; T2*, inverse of linewidth of inhomogeneous broadening; Usually: T2, inverse of transition linewidth in homogeneous broadening system; T2*, inverse of transition linewidth in inhomogeneous broadening system. In time do

27、main, T2 or T2* can be directly measured with Free-induction decay, optical nutation, photon-echo etc.,73,Superfluorescence-Past,Observation in gaseous medium: homogeneous broadening dominant system.,74,Observation in gaseous medium,-M. S. Feld, Phys. Rev. Lett. 30, 309 (1973).,Milestone 1: 1st SF i

28、n HF gas in 1973.,tD, ring, shot-shot fluctuation.,75,Observation in gaseous medium,Cascading SF in Na vapour.,-S. Haroche, Phys. Rev. Lett. 36, 1035 (1976).,tD, ring, ISF N2, tD 1/N.,76,Observation in gaseous medium,SF quantum beats and ring development in Cs vapour.,-Vrehen, Hikespoors, Gibbs, Phy

29、s. Rev. Lett. 38, 764 Phys. Rev. A 29, 2709 (1984).,Milestone 2: crystalline solid.,tD, shot-shot fluctuation.,80,Observation in KCl:O2-,R. W. Boyd, Phys. Rev. Lett. 59, 1189 (1987).,Quantum noise in SF,81,Observation in GaAs,Coherent elctron hole state and femtosecond cooperative emissin in bulk Ga

30、As. - P. P. Vasilev, Quantum Electronics 32, 1105 (2002).,tD ? development ? quantum noise ? shot-shot fluctuation ?,82,Observation in GaAs QW,Cooperative recombination of a quantized high-density electron-hole plasma in semi- conductor quantum wells-D. H. Reitze, Phys. Rev. Lett. 96, 237401 (2006).

31、,tD ? Any data on time-domain ?,83,Observation in ZnO nano-crystal,Super-radiance of excitons in a single ZnO nanostructure. -H. Z. Wang, Appl. Phys. Lett. 93, 151902 (2008).,tD ? development process of SF / quantum noise ?,Which might be correct on lasing mechanism? Microcavity lasing behavior of o

32、riented hexagonal ZnO nanowhiskers. -ZR Qiu, KS Wong, Appl. Phys. Lett. 84, 2739 (2004). Multiphoton absorption induced amplified spontaneous emission from ZnO nanorods. SX Qian, Appl. Phys. Lett. 92, 23316 (2008).,84,Superfluorescence-Recent,Observation in crystalline organic solid: homogeneous system with inhomog