第五章 诊断酶学.ppt

1、第五章 酶学分析技术,退出,主要内容,六、工具酶及其临床应用,一、酶的一般特征,二、酶促反应动力学,三、酶活性浓度测定技术,四、 酶的免疫化学测定,五、 同工酶和亚型的测定,七、血清酶,八、临床常用血清酶及其同工酶,一、基本概念,第一节 酶的一般特征,三、酶的命名分类及编号,二、酶的结构与催化作用,返回章,1. 酶、核酶。 2. 酶的催化特性：极高的催化效率、高度的特异性、催化作用的可调节性。 3. 酶促反应：酶所催化的反应。 酶活性：酶催化反应的能力。 酶活性单位：在一定条件下使酶促反达到某一速度时所需要的酶量。 底物(S)：酶所作用的物质。 产物(P)：酶促反应的生成物。 酶的激活剂: 加

2、速酶促反应的物质。 酶的抑制剂: 减慢或终止酶促反应的物质。,一、基本概念,返回节,二、酶的结构与催化作用,单纯酶和结合酶 单纯酶：只含多肽链，是单纯蛋白质。 结合酶：由酶蛋白和辅因子组成。 两者结合后形成的复合物称为全酶。 与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。 与酶蛋白结合牢固的称为辅基。 酶的活性中心 酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域。 酶的催化作用机制 诱导契合学说。,返回节,三、酶的命名、分类及编号,返回节,一、米曼氏方程,酶促反应动力学,三、酶促反应进程曲线,四、影响酶促反应的因素,二、Km与Vmax,返回章,Michaelis 和Menten提出的酶作用的中间产物学

3、说:,一、米曼氏方程,E+S,K1,K2,K3,返回节,1913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的 方程式，即米-曼氏方程(Michaelis-Menten equation):,E+P,ES,二、Km与Vmax,Km值：等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半 时的底物浓度，即VVmax时，则KmS。Km 在临床上的应用： 反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。 用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的百分率。 根据Km值选择酶的最适底物。 确定工具酶用量。 确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依 据。 Vmax：酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一 定酶量

4、下的最大反应速率。,返回节,酶促反应时间进程曲线(S为底物，P为产物),三、酶促反应进程曲线,如将酶反应过程中测得的产物P或底物S变化量对时间作图，可得酶促反应时间进程曲线。图中产物P或底物S变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。,延滞期,线性反应期,底物耗尽期,必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算出酶活性浓度。,返回节,四、影响酶促反应的因素,底物浓度对酶促反应的影响 （1）当SKm时，反应速率与底物浓度S无关， VVmaxK E 称为零级反应，反应速率与酶浓度E成正比。酶学测定时一般底物浓度可选择为Km的1020倍。,返回节,常见酶温度转化系数,酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度（v

5、）达到最大速度Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度E之间存在线性关系。,第二节 酶活性浓度测定技术,一、酶活性浓度测定方法,二、酶偶联法,三、血清酶活性浓度测定条件的选择,四、酶活性浓度的单位,五、系数K值的计算与应用,六、临床酶学测定的标准化,返回章,1.按反应时间分类: 定时法 连续监测法 2.按检测方法分类： 量气法、分光光度法、荧光法 其它方法（ 放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极谱法、HPLC或生物发光法等）。,一、酶活性浓度测定方法,返回节,按检测方法分类底物或产物浓度的检测,返回节,定时法（固定时间法） 测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产

6、物变化的总量，计算酶促反应平均速度。 优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。 缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。 利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误差。,返回节,连续监测法 又称速率法或动力学法，指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间 的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶活 性浓度的方法。 优点： 无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂， 就反应物变化的多点测定结果连接成线，观察 到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活 性，结

7、果准确可靠。 要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自动生化分析仪都能达到这些要求。,返回节,连续监测法的种类,直接法 是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质，然后通过特殊的仪器直接检测。 基于NADH或NADPH的反应原理 ：LD、-HBD等 基于人工合成色素原底物 ：ALP 、GGT、AMS等 基于氧的消耗 ：各种氧化酶 间接法 是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质，需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的酶类非常有限，很多情况下不得不使用间接法。 化学法：如ChE的丁酰硫代胆碱测定法。 酶偶联法,返回节,用

8、自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上来讲V、v和L均为固定值，为常数，则将公式 简化为 如LD活性浓度，已知NADH的为6.22103cm-1.mol-1，血清量为50l，底物液为1ml，比色杯光径为1cm，则 F=1.05106/6.22 1030.051=3376,五、系数K值的计算与应用,返回节,连续监测法中常数K值的设置 测定酶的判断值或参考范围上限，保证测定的可靠，所 以转氨酶的常数K一般在3000左右，不少人宁愿在1500 左右。 应考虑到测定时间，测定时间短到0.5分，此时0.001嗓 音对每分钟A误差将是0.002，反之，测定时间延长 到2分钟，误差也小一半。即测定时

9、间长，则K值可以 设置大一些，如测定时间只有0.5分钟，K值一般不超 过4000。 改变K值最方便的途径就是改变标本稀释度，稀释倍数 愈大，K值愈大。,返回节,第七节 工具酶及其临床应用,一、工具酶,二、代谢物的酶法测定,返回章,概念 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性 的酶称为工具酶。 工具酶参与的指示反应 偶联H2O2工具酶及指示反应：如常用的 Trinder反应。 NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指 示反应：利用氧化-还原酶反应使其连接到 NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反应后，直接测定 NAD(P)H的变化量。,一、工具酶,返回节,工具酶的其他应用 酶循环法 固相酶,

10、酶循环法测定胆汁酸,返回节,多酶体系中酶促偶联反应分析,二、代谢物的酶法测定,终点法 概念： 在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐 减少而产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反 应趋于平衡，测定反应完全后待测物或产物变化的总量，即终 点法（又称平衡法）。 测定的基本条件： 待测物浓度S应远小于其米氏常数Km，此时任何时刻的 反应速度 v=VS / Km，呈一级反应。 反应配方中所用酶量（V）应足够大，而Km应小，以保证 有较快的反应速度完成测定。,返回节,直接法 待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差 异，这种是最简单的代谢物浓度测定方法。 如尿酸在尿酸氧化酶作用

11、下生成的尿囊素在293nm有 特异的吸收峰，胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿 素造成450nm处的吸光度下降等。体内还有很多代谢物可 以直接测定，关键是需要相对应的酶。,代谢物的酶法测定终点法的类型,返回节,酶偶联法 与酶活性测定一样，直接法测定的项目是有限 的。每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测 方法。 如甘油三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指示反 应主要分两大类：NAD（P）H和过氧化物酶（POD）系 统。,代谢物的酶法测定终点法的类型,返回节,Ex 为待测酶，A为底物，B为中间产物。 A、B二物质的变化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei(为指示酶)，其底物为B，反应产物为P可直接测

12、定。,二、酶偶联法,返回节,酶偶联反应 最简单的模式为：,辅助反应 如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。模式为：,返回节,其中，B、C均为中间产物，Ea、Ei都为工具酶。最后一个酶称指示酶Ei，其他外加的酶都为辅助酶（Ea）。,酶偶联反应原理 (1) 当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存在几个时期： 预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期。 (2) 延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢且不稳定，称为延滞期。在这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。 (3)

13、设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短越好，测定时间要避开此期。,返回节,对酶偶联反应的要求 指示酶反应必须是一级反应 酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。 工具酶 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。,返回节,酶偶联法测定ALT的吸光度变化图,返回节,动力学法 概念： 根据米氏方程，当SKm，一般S/Km0.2，最好 0.05，S+KmKm，此时呈一级反应，反应初速 度v=kS。如果能准确测定反应的初速度（v），采用标

14、 准浓度对照法即可求得待测物的浓度。 实际操作中，测定两个固定时间的吸光度差值，只 要此期间待测物消耗5%，就可以采用标准浓度对照法计 算样本浓度，所以动力学法有时又称为定时法。,返回节,与终点法相比，动态法测定中待测物无需完全转化，故工具酶 的用量较少，为了保证有足够的测定线性，所用酶的Km应足够 大。 两者对于测定仪器的要求不同。终点法测定对于仪器的电噪声 和温控要求不严，而动态法要求仪器的电噪声小，吸光度应读 准到0.0001，温度变化0.1%。 产物的堆积和样品色原对动态法影响较小，而对终点测定法 影响较大。如碰到乳糜或溶血，在做终点法测定时，有时需 设样本空白。,终点法与动力学法的主

15、要区别,返回节,第六节 同工酶及亚型的测定,一、同工酶的概念及分类,二、同工酶的分析方法,返回章,概念： 同工酶是催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、 理化性质不同的一组酶。 亚型指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异形成的 多种形式的一类酶。往往在基因编码产物从细胞内释入 血浆时因肽酶作用降解而形成。 分类： 简单分类原级同工酶和次级同工酶。 基因分类单基因决定的同工酶、复等位基因同工 酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类。,一、同工酶的概念及分类,返回节,二、同工酶的分析方法,返回节,电泳法,电泳材料：醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦及毛细管电泳等。 区带显色

16、：各同工酶区带进行酶促反应显色后，扫描定量，而颜色的深浅与同工酶活性成正比。 巨分子酶产生的原因： 酶与免疫球蛋白形成复合物，如CK-BB-IgG 。 酶与其他蛋白质形成复合物，如LD-脂蛋白 。 酶亚基或分子之间形成聚合物，如CK-Mt聚合物、LD亚基自身聚合等。,返回节,层析法：利用同工酶分子量大小、所带电荷多少的不 同，以及受某些离子交换剂吸附的强弱程度不同来进 行分离鉴定的方法。 柱层析，如离子交换层析和亲和层析等。因操作方法 费时繁琐，一般不用于临床同工酶常规检测，而主要 用于同工酶的分离、制备、纯化。,层析法,返回节,免疫抑制法 根据同工酶的某一种亚基与相应的抗体 结合后，酶活性受

17、到抑制，可算出该型同工酶的活性。 如CK-MB活性测定。 免疫沉淀法 该法利用同工酶抗体形成抗原抗体复合 物沉淀的原理，减去法可算出同工酶的活性。 其他免疫学方法测定酶蛋白 利用酶是蛋白类抗原但 含量极微的特点，可应用免疫电泳、RIA、EIA和 CLIA等方法。这类方法的最大特点就是与酶活性无关， 测定酶的质量。,免疫分析法,返回节,底物特异性分析法 利用不同的同工酶对底物的亲和力 的差异即可进行分析。 抑制剂分析法 利用同工酶之间结构的不同而对同一种 抑制剂有不同的亲和性和反应性来进行分析。 pH分析法 利用不同的同工酶可有不同的最适pH进行分 析。 热失活分析法 利用不同同工酶的耐热性不同

18、来进行分 析与鉴定。,动力学分析法,返回节,一、血清酶的来源,第七节 血清酶,三、血清酶的生理变异,四、血清酶变化的病理机制,二、血清酶的去路,返回章,血浆特异酶 为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的 催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入， 在一定条件下被激活起作用。与凝血有关的酶或酶 原、ChE、Cp及LPL等。 非血浆特异酶 外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的 酶,包括P-AMY、P-LPS、前列腺ACP等。 细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶， 随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其 大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受 损，最常用于临床诊断。,一、血清酶

19、的来源,返回节,二、血清酶的去路,血清酶的半寿期 (T1/2) 定义： 酶失活至原来一半时所需时间。 半寿期代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶，在血清中持续时间长。 血清酶的失活和排泄 酶的清除主要是在血管内失活或分解。 血清酶经蛋白酶水解产物（多肽或氨基酸） 可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基酸后被重吸收，其中大部分可被组织利用，不能利用的氨基酸则随尿排出体外。,返回节,方法条件的选择 尽可能采用连续监测法；减少步骤, 化学试剂有一定纯度,双蒸水,使用双试剂。 测定参数的设置 方法类型、波长、样品量与试剂量、 稀释水量、试剂吸光度上下限、空白速率、反应孵育时 间、延迟,监测时间、底物耗

20、尽限额、线性范围及计算 因子F值。 标本的采集、运输与保存 影响因素：溶血、抗凝剂、温度等。 干扰因素的控制 反应干扰。污染。底物自行发生反 应。,三、血清酶活性浓度测定条件的选择,返回节,不同贮存温度时体液酶的稳定性,*酶不耐融化；与同工酶类型有关；标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至pH 5,临床常用血清酶的测定方法与参考范围（37）,*国际临床化学联合会（IFCC）参考方法； #实际为拟胆碱酯酶（PChE）,返回节,三、血清酶的生理变异,1.性别 少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异，与血清酶的 来源组织有关。 2.年龄 血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到老年时可有 轻度升高。

21、年龄差异也见于同工酶。 3.进食 过量饮酒可使血清GGT明显升高。 4.运动 多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT 等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及 骨骼肌所含的酶量有关。 5.妊娠 胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、 LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升 高。 6.其他 一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变 化及家庭因素有关。,返回节,酶合成异常 合成减少 合成增多 酶释放增加: 大多数血清酶增高的主要原因 细胞内外酶浓度差异 酶蛋白分子量的大小 酶的组织分布 酶在细胞内定位和存在形式 酶的清除异常 不同疾病和不同的

22、酶从血中清除时间和机制不同。 如AMY和ALP经肾脏或胆道排出异常而致血清酶升高。,返回节,四、血清酶变化的病理机制,一、血清酶的来源,第七节 血清酶,三、血清酶的生理变异,四、血清酶变化的病理机制,二、血清酶的去路,返回章,血浆特异酶 为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的 催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入， 在一定条件下被激活起作用。与凝血有关的酶或酶 原、ChE、Cp及LPL等。 非血浆特异酶 外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的 酶,包括P-AMY、P-LPS、前列腺ACP等。 细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶， 随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其 大量

23、出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受 损，最常用于临床诊断。,一、血清酶的来源,返回节,二、血清酶的去路,血清酶的半寿期 (T1/2) 定义： 酶失活至原来一半时所需时间。 半寿期代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶，在血清中持续时间长。 血清酶的失活和排泄 酶的清除主要是在血管内失活或分解。 血清酶经蛋白酶水解产物（多肽或氨基酸） 可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基酸后被重吸收，其中大部分可被组织利用，不能利用的氨基酸则随尿排出体外。,返回节,方法条件的选择 尽可能采用连续监测法；减少步骤, 化学试剂有一定纯度,双蒸水,使用双试剂。 测定参数的设置 方法类型、波长、样品量与试剂量、 稀

24、释水量、试剂吸光度上下限、空白速率、反应孵育时 间、延迟,监测时间、底物耗尽限额、线性范围及计算 因子F值。 标本的采集、运输与保存 影响因素：溶血、抗凝剂、温度等。 干扰因素的控制 反应干扰。污染。底物自行发生反 应。,三、血清酶活性浓度测定条件的选择,返回节,不同贮存温度时体液酶的稳定性,*酶不耐融化；与同工酶类型有关；标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至pH 5,临床常用血清酶的测定方法与参考范围（37）,*国际临床化学联合会（IFCC）参考方法； #实际为拟胆碱酯酶（PChE）,返回节,三、血清酶的生理变异,1.性别 少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异，与血清酶的 来源组织有关。

25、2.年龄 血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到老年时可有 轻度升高。年龄差异也见于同工酶。 3.进食 过量饮酒可使血清GGT明显升高。 4.运动 多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT 等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及 骨骼肌所含的酶量有关。 5.妊娠 胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、 LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升 高。 6.其他 一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变 化及家庭因素有关。,返回节,酶合成异常 合成减少 合成增多 酶释放增加: 大多数血清酶增高的主要原因 细胞内外酶浓度差异 酶蛋白分子量的大

26、小 酶的组织分布 酶在细胞内定位和存在形式 酶的清除异常 不同疾病和不同的酶从血中清除时间和机制不同。 如AMY和ALP经肾脏或胆道排出异常而致血清酶升高。,返回节,四、血清酶变化的病理机制,第八节 临床常用血清酶及其同工酶,二、-谷氨酰转移酶及其同工酶,三、肌酸激酶及其同工酶,四、乳酸脱氢酶及其同工酶,五、碱性磷酸酶及其同工酶,六、酸性磷酸酶及其同工酶,七、淀粉酶及其同工酶,八、脂肪酶,九、胆碱酯酶,一、转氨酶及其同工酶,返回章,一、转氨酶及其同工酶,生化特性 ALT 、 AST 以磷酸吡哆醛（维生素B6）作为辅基， 单纯的酶蛋白无催化活性。 组织分布 ALTs、ALTm，AST 、 AST

27、m 正常血清主要为ASTs，当细胞受到轻度损 伤时ASTs 显著升高。若血清中出现大量的 ASTm，则表示细胞严重受损。,返回节,转氨酶的测定方法 目前，国内外实验室多采用连续监测法进行测定。,返回节,ALT速率法测定中酶偶联反应式为：,AST速率法测定中酶偶联反应式为：,转氨酶测定的临床意义 急性肝损害 ALT的升高常与病情轻重相平行，可作为判断急性肝炎 是否恢复的指标。常是肝坏死的前兆。 心脏、骨骼肌等组织受损、肝胆疾病时 血清ALT水平也可出现不同程度的升高。 在AMI患者胸前区疼痛发作后68h，血清AST可明显升 高，发病后4860h达峰值，45天可降至正常。 转氨酶 轻度增加(13U

28、LN) ：胰腺炎、酒精性脂肪肝、肝硬 化、肉芽肿、肿瘤等。 中度增加(310ULN)的疾病：传染性淋巴增多症、慢性 活动性肝炎、肝外胆道梗塞、心肌梗死等。 重度增加(20ULN)的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。,返回节,二、-谷氨酰转移酶及其同工酶,生化特性 -GT或GGT 是一种含巯基的线粒体酶。 组织分布 分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织 中，其中以肾脏含量最多。 GGT在细胞中有膜结合型（疏水型）和可溶型（亲 水型）两种。 血清中GGT主要来源于肝胆系统。,返回节,GGT的测定方法 以往国内多以L-谷氨酰-萘胺或L-谷氨酰-对硝基苯胺等人工合成底物进行比色法测定（即重氮试剂法）

29、。由于底物水溶性差，缓冲液和 pH 对结果影响较大，现已较少应用。目前国内外多采用连续监测法测定血清-GT活性。,返回节,IFCC参考方法 采用L-谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺(GCNA)作为底物，以甘氨酰甘氨酸（双甘肽）作为-谷氨酰基的受体。在pH7.7的条件下，-GT催化底物生成-谷氨酰双甘肽和黄色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，在410nm波长处直接连续监测，吸光度的增高速率与-GT活性成正比关系。,返回节,GGT测定的临床意义 (1)胆道疾病 胆石症、胆道炎症、肝外梗阻等升高明显。 (2)肝实质疾病 肝炎、脂肪肝、肝硬化时中度升高。 慢性肝炎活动期GGT多增高，非活动期则多正常。 原发性或

30、转移性肝癌时不同程度的增高。 (3)诱导作用 对乙醇性中毒的判断有一定的价值。 长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者升高。 (4) 同工酶 用醋酸纤维薄膜电泳可将GGT同工酶分为GGT1、GGT2、GGT3和 GGT4四种，正常人只有GGT2和GGT3。 重症肝胆疾病和肝癌时有GGT1出现；乙醇性肝坏死、胆总管结 石及胰腺炎时GGT2增加；GGT4与胆红素增高相关。,返回节,三、肌酸激酶及其同工酶,生化特性 肌酸激酶为巯基酶，易受金属离子Ca2、Cu2、Zn2、 Mn2等的抑制，Mg2是CK的必需激活剂。由两种不同亚基（M 和B亚基）组成的二聚体。 按电泳速率的快慢分为：CK-BB（CK1

31、）、CK-MB（CK2）、 CK-MM（CK3）和CKMt(CK4)四种同工酶。 组织分布 广泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑组 织。 CK-BB在脑和脊髓内含量最高称为脑型同工酶。分为氧化 型、中间型和还原型3种亚型。 CK-MB主要存在于心肌细胞内称为心型同工酶。分为 CK-MB1CK-MB2亚型。 骨骼肌中几乎全部为CK-MM，称为肌型同工酶。分为 CK-MM1CK-MM2CK-MM3亚型。,返回节,CK的测定方法 有比色法、紫外分光光度法和荧光法等。由于以磷酸肌酸为底物的逆向反应速度快，约为正向反应速度的6倍，所以采用逆向反应进行测定较为普及。如肌酸显色法和酶偶联法，其中以

32、后者最常用，有两种工具酶及指示酶参与反应。 IFCC测定CK的参考方法为酶偶联法。,返回节,CK同工酶和亚型的测定方法 临床常规测定CK同工酶多用电泳和免疫抑制法，但二法均会受溶血和巨CK的干扰，免疫抑制法还会受到CK-BB的干扰。 现推荐用免疫化学方法直接测定CK-MBmass，可不受溶血和巨CK的干扰。 CK同工酶亚型（CK-MM亚型和CK-MB亚型）多用琼脂糖凝胶高压电泳和等电聚焦电泳等。,返回节,正常和病理状况时琼脂糖凝胶电泳分析血清CK同工酶可能出现的酶带,返回节,CK及其同工酶测定的临床意义 主要用于早期诊断AMI （1） 血清CK总活力 AMI后24h开始升高，1024h达峰值，

33、34天恢复正 常。 （2）CK同工酶及亚型 AMI胸痛发作后，血清CK-MB的上升先于其CK总活性， CK- MB/CK0.03可诊断为AMI。 CK-MM亚型的测定：以CK-MM3/CK-MM11.0作为诊断AMI的 标准。 CK-MB2亚型：在AMI早期诊断和判断有无再灌注上同样有很 高的灵敏度和特异性。一般以CK-MB21.9U/L或CK-MB2/CK-MB11.5作为AMI的诊断标准。,返回节,四、乳酸脱氢酶及其同工酶,生化特性 乳酸脱氢酶是糖酵解途径中的一种重要酶。LD除催 化L-乳酸外还可催化-羟丁酸、-酮丁酸进行脱氢反 应。 组织分布 LD位于细胞质中，是一种含锌的糖酵解酶。LD

34、是 由H（心型）和M型（肌型）两种不同亚基组成的四聚体。 5种同工酶。 若用-羟基丁酸作为底物，可测定H亚基的活性。,返回节,LD的测定方法 目前多用连续监测法。 LD-P法：以丙酮酸为底物（反应方向PL）的逆向反应（称LD-P法）。 LD-L法：以乳酸为底物（反应方向LP）的顺向反应（称LD-L法）。为IFCC参考方法（pH为9.4）。通过在340nm波长处监测NAD+ 还原成NADH吸光度的增加速率而计算LD活性。,返回节,LD同工酶的测定方法 常用电泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。目前以琼脂糖凝胶电泳法更多用。一般成年人存在如下规律：LD2LD1LD3LD4LD5，部分正常儿童血中可见L

35、D1LD2。,返回节,LD及其同工酶测定的临床意义 心肌梗死 LD心肌酶中升高最晚，持续时间长。 急性肝炎、慢性活动性肝炎和肝癌(尤其转移性肝癌)时，LD明显 升高。 LD同工酶主要用于AMI和肝病的诊断 AMI LD1升高最为显著，LD1/LD21，视为诊断AMI的一个特异指标。 肝胆疾病 LD5升高常表示有肝细胞坏死。肝细胞性黄疸时LD5LD4，阻塞性黄疽时LD4LD5。 肿瘤 肝癌(尤其转移癌)时可伴有LD4和LD5明显增高；白血病、胶原病时以LD3、LD4增高为主。 恶性贫血 LD活性极度升高(原始巨幼红细胞可产生并释放LD)，伴有LD1明显升高，LD1LD2。,返回节,AMI时心肌酶

36、时相变化,返回节,五、碱性磷酸酶及其同工酶,生化特性 碱性磷酸酶是一组底物特异性较低,在碱性条件下（最适 pH为10左右）能水解很多磷酸单酯化合物的酶。 组织分布 ALP广泛分布定位于细胞膜表面，其含量依次为肝、肾、 胎盘、小肠、骨骼等。 血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼，是胆汁淤滞的酶学指 标。 根据ALP的来源不同可以3大类，即胎盘ALP、肠ALP和 肝/骨/肾ALP同工酶。在病理时还可能出现肝ALP和胆汁ALP 等“高分子ALP” ，以及一些和肿瘤有关的变异ALP，如 Regan、Nagao ALP等。,返回节,ALP的测定方法 (1)磷酸苯二钠比色法：测定ALP水解底物产生的酚。 (2

37、)连续监测法：我国及IFCC的推荐方法。,返回节,ALP测定的临床意义 肝胆疾病 各种肝内、外胆管阻塞引起的胆汁淤积性疾 病，ALP明显升高，且ALP升高与胆红素平行 甲亢、恶性骨损伤、佝偻病、Pagets病、骨折、指端肥大 症所致骨损伤等，均可引起ALP活性升高，尤其是骨ALP同 工酶的增高 妊娠后期及儿童生长期ALP增高 血清ALP活性降低：主要见于呆小病、维生素C缺乏症、甲 状腺功能低下、恶性贫血等。,返回节,六、酸性磷酸酶及其同工酶,生化特性 酸性磷酸酶是一组对底物专一性不强、在酸性条件下水 解各种正磷酸单酯的酶。 组织分布 ACP主要存在于体内所有细胞的溶酶体中。 血清中ACP主要来

38、源于前列腺，称为前列腺ACP（PAP），它 可被酒石酸抑制；其活性约为其他组织中酶活性的100倍。非前 列腺ACP，不被酒石酸抑制。 正常男性血清中的ACP约有1/31/2来自前列腺，其余则与 女性血中的ACP一样可能来自血小板或破骨细胞。,返回节,ACP的测定方法 ACP的测定底物、原理和方法与ALP 相似，只是反应pH为 酸性。如利用磷酸苯二钠法和磷酸对硝基酚法等在酸性条件下 测定ACP。国外多推荐使用磷酸麝香草酚为底物的比色法。 可通过用L-酒石酸这类抑制剂鉴别和估量PAP活性。由于 ACP不稳定，酶活性测定困难，目前已发展一些免疫学方法 特异而灵敏地测定ACP（特别是PAP）。 血标本

39、采取后必须尽快分离血清并立即测定。不同方法 参考范围也不同。,返回节,ACP测定的临床意义 前列腺疾病 血清PAP测定是诊断前列腺癌最重要的指标之一。在 前列腺肥大、前列腺炎、急性尿潴留时亦可升高。酒石酸抑制试 验可区别PAP与非PAP。 骨病 恶性骨肿瘤、变形性骨炎、多发性骨髓瘤、骨质疏松、代谢 性骨病等轻度增高。 肝病 肝癌、肝硬化肝炎时ACP增高。 血液病 溶血性疾病、白血肉、血小板疾病等，ACP均有不同程度 的升高。,返回节,七、淀粉酶及其同工酶,生化特性 -amylase（AMY或AMS）是一种不均一性的钙依赖 金属蛋白酶。AMY作用的最适pH在6.57.5，卤素和其 他阴离子有激活

40、作用（ClBrNO3I）。 分子量4000050 000，易从肾脏排出。半寿期很 短，约为2h。,返回节,组织分布 -AMY分为两种同工酶：S-AMY和P-AMY。 利用醋酸纤维薄膜电泳或琼脂糖电泳可将S-AMY 分为S1、S2、S3和S4四个亚型；P-AMY分为P1、P2、 P3三个亚型。 P-AMY和S-AMY可单独或联合与抗淀粉酶自身抗体 以非共价形式结合，形成高分子循环复合物，称为 巨淀粉酶（M-AMY）。M-AMY的分子量较大，不易从 肾小球滤过，因此容易造成高淀粉酶血症。,返回节,AMY的测定方法 AMY总活性测定：化学法、酶偶联法。 根据底物不同分为两类。一类是以天然淀粉为底 物的测定方法。如碘淀粉比色法等。另一类底物是人 工合成的麦芽多糖为底物的测定方法，这类方法是国 内外目前应用最多的方法。如2-氯-对硝基苯麦芽三 糖苷（CNP-G3）和亚乙基封闭的对硝基苯麦芽庚糖苷 （4NP-G7）法（亦称EPS 法），以后者最常用。 EPS法测定AMY,返回节