第八章基因工程下游技术

1、第八章基因工程下游技术，2011-10-30，1，基因工程下游技术，1，概述，生物技术是利用生物的特定功能或潜力进行生产的工程技术。利用大肠杆菌、酵母等生产哺乳动物的蛋白质和重要药物等都是应用生物技术的例子。目前，全世界用生物技术生产的数以千计的医药和生物产品，年产量达数百亿美元。抗生素、人类人生长激素、人类干扰素、乙型肝炎疫苗等生物科技产品在我国投入使用。生物技术通常分为发酵工程、细胞工程、酶工程、基因工程、蛋白质工程等。生物技术以生命科学为基础，将多种基础科学相结合，然后产业化。2011-10-30，2，基因工程下游技术，也称为基因工程，基因工程或重组DNA技术。它从某种生物手动获得了被称

2、为目标基因的特定DNA片段。通过基因载体将目标基因输送到受体宿主活性细胞，并进行无性生殖(“克隆”)和正常功能(“表达”)，产生新生物品种或新物种的遗传学技术。一般来说，基因工程是指通过将来自不同生物化学来源的遗传物质(同种或原核、原核或真核、天然或人工DNA片段)与向量系统(病毒、细菌质粒或噬菌体)的DNA结合起来，制造再生者的方法。这样制作的混合成分者可以从有复制者的宿主生物或细胞中复制，转化为宿主细胞，或者通过转染、转基因、生长、筛选等，克隆为无性生殖。然后，可以直接利用变形者，或者将复制的分子分离，然后引入适当的表达体系，重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。2011-10-30，

3、3，基因工程下游技术，生物技术产业经过多年的努力，制造了35种重要的治疗药物，年销售额超过70亿美元。全世界已有2000多家生命技术制药公司，其中美国有1300家，欧洲有700家。1997年美国的生物技术研发费用为76亿美元，欧洲为18亿美元。目前，主要的生物技术公司分布在美国，如Amgen、Genetics institute、Genzyme、Genentech和Chiron，Biogen也在快速增长。市面上的生物技术药物主要包括蛋白质的重组治疗、疫苗重组、诊断或治疗的单克隆抗体等三大类别。2011-10-30，4，基因工程下游技术，我国基因工程医药产业化品种无，开发了10多种。这些是rHU

4、IFNlb，rHUIFN2a，rHUIFN2b，rHUIFN，重组乙型肝炎疫苗等。第二，基因工程产品生产工艺，原料，上游工艺，发酵或生物转化，下游工艺，产品应用，2011-10-30-5，基因工程下游技术，原料菌种，载体，工具酶发酵或生物转化通过优化温度、营养、气体供应等发酵条件进行发酵或大规模培养，利用工程菌的生物合成、加工和转化等获取目的产物。备用菌株种子罐培养作为发酵的菌种发酵(包括发酵罐、培养基优化、发酵条件优化等)。动植物的细胞培养：悬浮培养，固体培养；自动限制。2011-10-30，6，基因工程下游技术，基因重组技术构建的基因工程菌的发酵过程不同于传统的发酵过程。对于选定的生物材料

5、，电子包含具有外源基因的重组载体；后者是单个微生物细胞。考虑到发酵过程，生物工程菌的发酵生产目的是获取大量外源基因产物，并将宿主细胞自身的蛋白质表达降至最低。不仅宿主、载体、克隆基因之间的相互关系，而且与其环境条件密切相关的外来性基因的高水平表达，光靠传统的发酵过程生产生物产品是不够的。要分析影响外源基因表达的因素，探讨适合外源基因高效表达的发酵过程。2011-10-30，7，基因工程下游技术，工程菌高密度发酵，实现高密度培养，是近年来发酵工业的重要目标和方向之一，是工程菌能否以尽可能少的成本实现规模生产的关键因素之一。高细胞密度培养可以增加目标产物的浓度，有利于提取和纯化，减少相同产量下反应

6、堆的体积。1宿主细菌的选择1.1重组细菌的稳定性1.2启动子的选择和刘涛2培养条件的选择营养，溶解氧，温度，pH 3培养方法的部署，连续和饲料分批培养，2011-10-30，8，基因工程下游技术，下游工艺是从发酵液中分离纯化产品的技术过程，固体-液体分离最后，包括产品的包装处理技术(真空干燥、董洁干燥等)在内的产品，使用生化、物理方法分离、精制产品，最终将产品推向市场，获得社会或经济效益的过程。三是下游工艺，2011-10-30，9，基因工程下游技术，(1)细菌处理。微生物或动植物细胞培养的产品是细胞或培养液，必须分别处理。在发酵过程中，除了增殖许多细菌外，发酵液中混合的残留物还可以通过适当加

7、热调节ph或添加絮凝剂，使菌体与发酵液分离。悬浮液的菌体通过过滤或离心分离。除了添加过滤助剂外，还可以使用真空过滤提高效率。离心通常使用自动间歇排渣离心机或喷射离心机。菌体分离后，必须进行灭活和粉碎。物理粉碎可以用研磨法或挤压法均匀，也可以用超声波振动法使介质产生空化，从而产生冲击波。酶处理可以在细胞壁上特定地催化水解，暴露原生质体在低渗透条件下进一步破裂，释放细胞内容物。(2)细胞外产品上等液的处理。除菌的上等额可以通过加热或调整pH来去除杂质蛋白。絮凝剂提取分离青霉素g；等电点法沉淀谷氨酸(msg)；一些酶制剂可以以硫酸铵的一定浓度进行盐分。色谱分离使用不同的裴秀智和溶剂系统，根据该系统内

8、产品的分布进行吸附或凝聚。其中亲和层析对酶或蛋白质的分离和纯化效果良好。(3)最终精制产品是化妆董洁干燥后，包装后的成品。2011-10-30，10，基因工程下游技术在进行任何蛋白质纯化工艺设计之前，需要了解尽可能多的纯化系统、目标蛋白和杂质的性质。目标蛋白的相对分子质量、等电点、疏水、带电性、碳氢化合物或自由巯基存在等。此外，为了确保精制的蛋白质活性，还必须确定影响目标蛋白活性的因素，如温度、h、有机溶剂、蛋白质变性剂、重金属离子、机械剪切力等。目前蛋白质的纯化主要依靠色谱(色谱)和电泳技术。重组蛋白在组织和细胞内仍然以复杂的混合物形式存在，因此目前还没有分离或完全现成的方法将任何蛋白质从复

9、杂的混合物中分离出来，只是根据目标蛋白的理化性质，通过组合寻找适当的分离程序集，选择上述方法，可以获得高纯度的产品。，2011-10-30，11，基因工程下游技术，1。粗分离，1.1粉碎细胞大肠杆菌：选择董洁融化，超声波，溶菌酶动物，植物细胞：均化，粉碎1.2萃取1.pH: Tris，磷酸，醋酸酯，柠檬酸盐缓冲剂等适当pH的缓冲液，确保在此pH条件下分离蛋白的稳定性。一般缓冲液浓度为20-50 mM。温度：低温，如4-10，蛋白酶活性低。3.离子强度：0.1-0.2 M NaCl或KCl。4.其他成分：还原剂，如NaHSO4、维生素c；巯基保护剂DTT，巯基乙醇；金属螯合剂EDTA、EGTA；

10、蛋白酶抑制剂PMSF等。2011-10-30，12，基因工程下游技术，1.3初步分离1。小器官分离：离心，草原心2。核酸去除：酶DNase，RNase；超声波3。脂肪去除：丙酮，脂肪酶1.4粗蛋白1。盐析：NaCl，(NH4)2SO4沉淀2。有机溶剂萃取：甲醇、乙醇、丙酮3。等电点沉淀：异质蛋白去除4。热变性：杂蛋白1.5脱盐1。超滤2。凝胶过滤3。董洁干燥，2011-10-30，13，基因工程下游技术，处理介质溶剂平衡相清洗洗脱介质再生，2。精细分离-色谱一般步骤：2011-10-30，14，基因工程下游技术，2.1凝胶过滤：根据分子量大小分离蛋白质，原理根据分子大小和形态分离。这是利用徐璐

11、不同大小的分子，以凝胶停留时间的差异分离混合物的柱层析方法。另一种说法是分离以分子体积的大小为基础，分子体积即分子溶剂化后的体积受分子形状和相对分子质量两个因素的影响。有时添加变性剂(尿素、盐酸胍等)破坏蛋白质的三四种结构，使分离主要受相对分子质量大小的控制。2011-10-30，15，基因工程下游技术，介质：(1)sephadox 3360(交联葡聚糖)g25，g50，g75，g100 bio-GL :(g100 bio-GL :)，2011-10-30，18，基因工程下游技术，离子交换色谱分离蛋白质分子的净电荷和表面电荷分布。特别是利用蛋白质带电性的差异，在离子吸附剂上静电吸附能力不同，用

12、不同的pH/离子强度洗脱液洗脱分离蛋白质的柱层析方法。离子交换分为阴离子交换和阳离子交换。洗脱方法：阳离子交换主要改变pH，等电点大于5的蛋白质。负离子交换主要通过改变盐浓度，适合大部分蛋白质。离子交换色谱吞吐量大，附着系数高，一次减少了很多样品体积。在热原质、核酸、外毒素、小牛血清中，像大部分蛋白质和有电荷差异的蛋白质一样，去除杂质的能力很强。离子交换色谱的溶出一般分为：的3种同时溶出、分步溶出、梯度溶出。2011-10-30，19，基因工程下游技术，离子交换介质：(1)离子交换树脂：(2)纤维素：DEAE-，CM- (3)葡聚糖SEphadex: sephadex弱酸性C-，CM-负离子：

13、强碱性TEAE-，QAE-，SE，SP-；中间碱基型：DEAE-螯合型：BA，CAI-，a，SAHP，2011-10-30，20，基因工程下游技术，2.3亲和层析，原理：利用蛋白质特异性进行分离。介质准备：托架选择：Sepharose 4B、Sepharose CL 4B、sepharose fasflow、se pharose High Performance space arm:连接小分子时需要空间臂，通常需要双功能组(选择配体：抗原抗体、酶抑制剂、酶基质、激素受体、金属结合蛋白螯合剂、巯基蛋白Hg或巯基分子凝集素糖蛋白结合：I溴化氰基：氨基偶联、高效、短反应时间，适合多种蛋白质的温和条件

14、。II环氧氯丙烷法：NH2，OH，与SH耦合，pH11，50等强条件，特别适合稳定蛋白质，2011-10-30，21，基因工程下游技术，亲和色谱分离和纯化目标单一的高回收率。理论上得到了相当纯的物质，这种分离能力不能与任何其他柱层析相比较，但亲和色谱柱制造工艺复杂，在色谱洗脱过程中，配体不可避免的脱落不仅限制了柱的寿命，还需要注射或服用产品，因此成本高，一般不优先于精制工艺。2011-10-30，22，基因工程下游技术，2.4金属螯合色谱，原理：蛋白质内组氨酸等氨基酸残基和介质中基于特殊金属离子的金属螯合，形成复合物以分离蛋白质。溶出方法：pH梯度溶出，竞争配体溶出，有机溶剂溶出，螯合剂溶出。

15、金属螯合色谱法纯化蛋白质时，由于暴露在金属和蛋白质表面的氨基酸残基的作用，该蛋白质分离时的分离率和回收率也很高，一般放置在精制过程中的后半部分。某些蛋白质、氨基酸和某些金属离子的特定亲和力，例如以下： Cu2和氮化合物、单核苷酸、人类有色白色。Ni和酪氨酸，含有色氨酸的蛋白质或多肽；含有Zn2和组氨酸、半胱氨酸的蛋白质或多肽。2011-10-30，23，基因工程下游技术，液相色谱是目前蛋白质分离中最常用的技术之一，在基因工程产品下游处理中占有主要地位。常见系统和介质Amersham pharmacia biotech蛋白质液相色谱系统(FPLC) AKTA系统高效液相色谱、2.5液相色谱、2011-10-30，24、基因工程下游技术、2.6其他下游分离技术、细胞粉碎的常用方法高压均质技术Lowry方法：蛋白质在碱性溶液中形成铜和配合物，还原磷钼酸盐钨试剂，产生蓝色。Bradford方法：基于蛋白质和考马斯亮蓝染料的组合进行测定。Kjeldahl biurea方法(2)纯度鉴定电泳：SDS页，IEF化学