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文档简介

1、Western Blot,原理 步骤 SDS-PAGE（蛋白质的分离） 蛋白质转移 蛋白质的免疫学检测,Western blot,一、原 理,蛋白质样品经过SDS-PAGE分离后，通过转移电泳或直接印迹方式原位转移至固相介质上，并保持原有的物质类型和生物学活性不变，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测。 SDS-PAGE依据：蛋白质分子量的差异 （1）SDS使蛋白质带有大量负电荷 （2） SDS、巯基乙醇作用下，结构松散，二硫键打开。,1、分离,（1）制胶 装配电泳槽 灌注分离胶 灌注浓缩胶 （2）样品处理 （3）电泳,2、转移,3、免疫学检测,封闭过夜 一抗37C 1h 洗3次 二抗37C 1

2、h 洗3次 底物显色5-15分钟 ddH2O洗涤,4、结果,10%分离胶,ddH2O 5.9ml 30%丙烯酰胺 5.0ml 1.5mM Tris(PH8.8) 3.8ml 10%SDS 0.15ml 10%过硫酸铵 0.15ml TEMED 0.01ml - 15ml,5%浓缩胶,ddH2O 4.25ml 30%丙烯酰胺 0.65ml 1.0mM Tris(PH6.8) 0.1ml 10%过硫酸铵 0.075ml TEMED 0.01ml - 5ml,试剂原理,SDS, 巯基乙醇(2-ME)- 强还原剂. AP-化学聚合的催化剂. TEMED-加速剂. PAGE-以单体和双体丙烯酰胺为材料,

3、在催化剂和加速剂作用下,聚合联接而形成的三维网状结构物质.,浓缩胶：主要是使样品在进入分离胶前被浓缩成很窄的圆盘状，从而提高了分离的分辨程度。 分离胶：被浓缩的盘状样品区带进入此胶内，根据各组分的分子量和电荷的不同而被分开。,Stacking Gel,Separating Gel,interface,_,+,Tris-glycine buffer, PH8.3,Tris-glycine buffer , PH8.3,Sample with loading buffer,Tris-HCl,PH6.8,PH8.8,SDS-PAGE,凝胶,NC膜,蛋白质转移,凝胶电泳结束前30min, 将PVDF膜先浸泡在甲醇中,再浸泡在转移缓冲液中, 在转移模具上由下至上依次放入: 若干张3mm滤纸,PVDF膜,凝胶, 滤纸.注意逐层驱除气泡(用玻棒或移液管)。 连接电极: 膜(+), 凝胶(-)。 接通电源, 20-30v,45min。,转移电泳,免疫学检测,Block: 1%BSA or 5%milk in TBS-T,overnight. Wash: PBS-Tween 3x5min.,Ab Incubation: HRP 标记的羊抗人IgG，效价随实际情况调整, 也可用打点法决定最佳效价。370c, 1h。Wash 3x5min。,Develop:

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