组织DNA提取原理和步骤 详细

1、，组织dna提取，tissue dna extraction，实验目的是学习从生物组织中提取dna，为研究dna的理化性质和结构功能打下基础。dna提取的一般原则：确保一核酸一级结构的完整性。2其他生物大分子(如蛋白质、多糖、脂肪分子)的污染必须最小化。3核酸样品中不应有抑制酶的有机溶剂和高浓度金属离子。其他核酸分子，例如4 rna，也应该尽量去除。、浓度情感，(a值为1时50g/ml双链dna，40g/ml单链dna或rna，20g/ml单链寡聚核苷酸)，各种碱的紫外线吸收光谱，2)适用于荧光分光光度法低浓度核酸溶液的定量分析。(1-5ng)，eb和dna的结合，从500l全血中提取的基因组

2、dna电泳，从动物组织中提取基因组dna，确认纯度，紫外线分光光度法：如果260nm和a260低于值，就可以知道制剂中仍有蛋白质成分。高于此值表示存在rna剩馀量。纯rna a260和a280的比率必须为2.0。a260/a280比是纯度检查的重要指标。完整性确认(integrity identification)，凝胶电泳法：基因组dna电泳，在电场中游泳缓慢，分解发生的话，电泳也可能发生脱发现象。总rna电泳观察每个带的含量，告诉我们是否有rna降解。如果额外的槽有带状，则可能是dna污染。核酸的储存dna保存，1)短期保存：4或-20保存在te(tris和edta)缓冲液中。te缓冲液的

3、ph与dna储存有关，ph为8可以减少dna脱氨反应，ph低于7.0时dna容易变性。2)长期存储：te缓冲液中-存储70年；在dna溶液中添加一滴氯仿可以有效地防止细菌和核酸的污染。每个组织的ml分解液组织菌机，匀浆2.0ml均质，等体积苯酚-氯仿，摇匀5min，2，500rpm 10min，水摄取量，等体积氯仿-异丙醇，摇匀5min，2，500rpm如果a260nm/a280nm等于1.6，则表明有蛋白质或苯酚污染，应进一步纯化。定量，dna浓度(g/ml)=a260nm 50稀释倍数1/光光*1od值等于50g/ml dsdna、40g/ml ssdna或rna，2og/ml升高核苷酸。

4、浓度计算，1 .分解液： 10 mmol/l ph 8.0 tris-hcl 1 mmol/l edta 0.1mol/l nacl 1% sds er聚合细胞中核蛋白降解；蛋白质和复合物的形成，2 .酚-氯仿(phenol-chloroform):酚：强蛋白质变性剂氯仿：蛋白质变性剂，不与水互溶，可与酚相互溶解，拿走剩下的酚。，为什么苯酚要严重饱和才能用于dna分离？苯酚在空气中经常氧化，形成自由基，可直接用于dna分离，磷酸二酯键断裂，dna分解。要氧化苯酚，必须在高温下再蒸，去除氧化物，用tris-hcl饱和苯酚中性调节。3 .氯仿-异丙醇：降低分子表面张力，减少萃取过程中泡沫的生成，异

5、丙醇帮助分相，保持离心后的上层水、中间层改性蛋白质、下层有机溶剂稳定。4。冰无水乙醇(absolute ethonal)和70%乙醇(70% ethonal):无水乙醇夺走dna周围的水分子，使dna失去水分，容易聚合。可以去除残留物的氯仿。70%乙醇洗涤去除残留的盐离子，盐离子的存在不容易溶解，抑制酶反应。5 .te缓冲(te buffer):10 mmol/l ph 8.0 tris-hcl 1 mmol/l edta缓冲不会对tris-hcl产生金属离子干扰，从而使edta稳定dna的激活。6.20%十二烷基磺酸钠(sds):抑制dnase活性，7.10mg/ml蛋白酶k(protase

6、 k):蛋白质分解，细胞膜破坏8.10mg/mlrna酶(rnase)dna释放不完全。离心力的小方面分离不完全。dna降解的原因样本不新鲜。采集物质在旧样品本身有大量dna酶提取dna的生物活性的原因吗？提取的基因组dna盐浓度过高的基因组dna中乙醇没有清除的纯基因组dna中，可能有其他抑制因素提取基因组dna，有时因为添加蔗糖的原因添加多糖保护dna长度，注意事项，1。处死动物后，要取出使用的器官，尽快放入液氮中，以免dnase引起dna分解。在纯化过程中，应加入核酸酶抑制剂(eg.edta)，防止dna自身分解。2.组织要尽量磨细。颗粒太大，细胞不能完全分解，随后dna会严重分解。3 .真核细胞dna分子量很大，机械张力容易引起dna分子