流式基本介绍.ppt

1、流式细胞仪及其临床应用,To help all people live healthy lives,1973年BD推出世界第一台流式细胞仪FACS I（Fluorescence Activated Cell Sorter） 1980年中国的第一台流式细胞仪FACS II 生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领域 FACS流式细胞仪市场占有率：全球75%，中国70%,台式机 FACSCalibur,双激光：488nm/635nm 四荧光六分析参数 动化程度高 分析速度快 灵活的设计 细胞分选系统 细胞富集系统,大型机 FACS Vantage SE,多激光多波长 八特征参数

2、 设计灵活 高速分选 单细胞点对点分选,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,流式细胞仪仪器结构,液流系统 光学系统 激光光源 光收集系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统,流式细胞仪的检测范围,细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量,细胞功能 细胞表面/胞

3、浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体,流式细胞仪的检测信号,散射光信号 FSC，前向角散射光，代表细胞大小 SSC，侧向角散射光，代表细胞粒度,流式细胞仪的检测信号,荧光信号 使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,双激光立体空间激发系统,双激光立体空间激发系统,Laser1,Laser2,信号脉冲处理Pulse Processing（DDM）,DDM (DoubletDiscrimination Module) 双粘体辨别DNA分析的解决之道,通过信号脉冲（FL2-W和FL2-A）分析区别实体组织标本中的粘连

4、细胞，最大程度减少假阳性,流式细胞仪的应用,淋巴细胞免疫分型 淋巴细胞亚群分析 CD4绝对计数 HIV的诊断与研究 淋巴细胞 CD4/CD8分析 CD4绝对计数 T细胞活化 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测,流式细胞仪的应用,免疫功能和免疫调控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化 细胞因子的研究 淋巴细胞的增殖 树突状细胞的研究 HLA-B27检测,流式细胞仪的应用,白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病 造血干细胞计数 PNH诊断 网织红细胞分析 血小板分析 血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化 网织血小板分析,流式细胞仪的应用,细胞周期分析 肿瘤相关基因表达的研究 多药耐药基因的研究 细胞凋亡的分

5、析 凋亡细胞的分析 凋亡相关蛋白的分析,淋巴细胞亚群分析,使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 各淋巴细胞亚群的百分含量 淋巴细胞亚群的绝对计数,临床意义,了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案 免疫系统疾病 免疫缺陷病，AIDS 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免疫力检测,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 NK细胞（CD3-CD16+5

6、6+），行驶免疫监控功能 根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为 T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+） T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+） Th/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血 活化T淋巴细胞：HLA-DR、CD38等,SimulTEST IMK-Lymphocyte淋巴细胞双色分析,使用双色分析试剂 样本使用EDTA抗凝全血，用血量600uL 使用SimulSET自动软件，进行样本的获取和分析 SimulSET软件自动做质量检查，帮助发现样本运输、处理等过程中造成的错误 医生报告T、B、NK淋巴细胞及TH、TS百

7、分含量和H/S比值，并报告参考值范围,SimulTEST IMK-Lymphocyte淋巴细胞双色分析,CD45/CD14，Leucogate：确定淋巴细胞门，评估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰 1/2a，阴性对照：确定淋巴细胞的阴性界值，评估实验的非特异染色 CD3/CD19：分析T淋巴细胞和B淋巴细胞 CD3/CD4：分析T辅助/诱导细胞 CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 CD3/CD16+56：分析T淋巴细胞和NK细胞,SimulTEST IMK-Lymphocyte淋巴细胞双色分析,LeucoGATE：Back-Gating，准确圈

8、定淋巴细胞门，并评估门的有效性,SimulTEST IMK-Lymphocyte淋巴细胞双色分析,TriTEST CD4/CD8/CD3分析与T淋巴细胞绝对计数,使用三色试剂 样本使用EDTA抗凝全血，用血量50uL 免洗操作，避免细胞丢失 TruCOUNT管预先加有已知数量微球，在流式细胞仪上直接得到T淋巴细胞亚群的绝对含量 使用MultiSET自动软件进行样本的获取和分析 MultiSET软件自动做质量检查，帮助发现样本运输、处理等过程中造成的错误 医生报告T淋巴细胞及TH、TS百分含量、绝对含量和H/S比值，并报告参考值范围,TriTEST CD4/CD8/CD3分析与T淋巴细胞绝对计数

9、,%T LymphCD3+ Abs Cnt CD3+CD4+ %T LymphCD3+CD4+ Abs Cnt CD3+CD8+ %T LymphCD3+CD8+ Abs Cnt T H/S Ratio,T淋巴细胞的体外激活与细胞因子的检测,T淋巴细胞在刺激原和抗原呈递细胞的作用下，发生活化反应 T淋巴细胞激活早期，即有早期活化标记CD69的表达（FastImmune系统） 在整个T淋巴细胞激活的过程中，不同激活标记交替表达 使用全血样本，接近体内环境,细胞活化,T淋巴细胞的体外激活与细胞因子的检测,T淋巴细胞活化后，可以分泌细胞因子，引起一系列T淋巴细胞诱导的免疫反应 I类免疫反应：以细胞免

10、疫反应为主 II类免疫反应：以体液免疫反应为主 T淋巴细胞激活后，发生细胞增殖反应,细胞活化及细胞因子的检测FastImmune系统,T淋巴细胞的体外激活与细胞因子的检测,免疫调节: 细胞因子/受体相互作用、 共受体/配体相互作用 病因学研究: AIDS、癌症、自身免疫性疾病 病毒细菌抗原引发T细胞亚群反应 机会感染导致细胞介导免疫反应 药物/疫苗疗效评价 化疗免疫状态评价 各种状态下免疫状态评价： 移植、寄生虫、营养失调、创伤手术、烧伤等,HLA-B27,HLA-B27是MHC I类抗原，在有核细胞上广泛表达 HLA-B27的表达与强直性脊柱炎高度相关，在其它血清阴性骨关节病也有明显表达 R

11、eiter，s综和症、银屑病性关节炎、葡萄膜炎等 使用流式细胞仪，可以快速、灵敏、准确地分析HLA-B27 BD HLA-B27 Kit检测HLA-B27，报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴性/阳性结果。实验的灵敏度为100%，特异性为97.5%,HLA-B27,HLA-B27阴性样本,HLA-B27阳性样本,白血病与淋巴瘤免疫分型,MIC分型 形态学检查 流式细胞仪免疫分型 细胞遗传学检查 白血病细胞的异常表现在系列异常和时间异常 FCM通过检测细胞表面或胞浆特异性的标记表达来对白血病进行免疫分型，报告白血病细胞百分含量和各种免疫表型的分布情况,白血病与淋巴瘤免疫分型,CD45 P

12、erCP/SSC分析样本，画门,造血干细胞计数,造血干细胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血细胞。 造血干细胞的特征是： 大小（FSC）和颗粒度（SSC）介于成熟淋巴细胞、大淋巴细胞相似 细胞内含有较多核酸物质 CD34表达弱阳性或强阳性 CD45表达弱阳性 在干细胞移植时需要做造血干细胞绝对计数,ProCOUNT造血干细胞计数,根据造血干细胞特征，进行三色分析NA/CD34 PE/CD45 PerCP ，多重设门，准确、特异地圈定CD34+干细胞 使用TruCOUNT绝对计数管，采用免洗操作，准确计算CD34+干细胞绝对含量 使用ProCOUNT自动软件，自动分析，自动做质量检查，报告

13、结果，重复性好 报告CD34+细胞百分含量和绝对含量，并可根据收获量和受者体重，自动计算出受者每公斤体重接受的干细胞数量，帮助判断干细胞移植的最佳时间,ProCOUNT造血干细胞计数,血小板活化,IIb/IIIa复合物（CD41/CD61）在所有静止和活化的血小板上都有表达 血小板活化时发生的改变 IIb/IIIa复合物发生变构，表达PAC-1 血小板内颗粒释放，分泌促进凝血反应的物质，这时，表达CD62P,血小板活化,流式细胞仪上采用三色分析，可以同时了解血小板活化时血小板的聚集功能和分泌功能的变化 直接使用全血，样本更接近生理状况 操作步骤简便、用血量少、避免体外活化与血小板亚群丢失 血小

14、板减少患者也能精确分析,PAC-1+RGDC/1 /CD61：阴性对照 PAC-1/CD62P /CD61：实验管，报告血小板活化百分含量,血小板活化,血小板活化,直接测量循环血小板活化状态与反应性 可直接测定凝血酶等诱导剂活化的血小板 血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成 心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关 预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性 缺血性脑血管病与血小板活化有关 子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加 抗血小板治疗疗效监测,DNA细胞周期分析,使用与核酸结合的PI染料染色，分析细胞的DNA周期分布 分析细胞倍体性 DI 分析细胞的增生情况 PI SPF,DNA分析的临床意义,DNA分析诊断肿瘤 DNA非整倍体细胞峰 突出的四倍体细胞峰 SPF10-15% DNA倍体分析： 结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。 增殖状态分析： 反映了肿瘤的生长速度和侵袭性,DNA细胞周期分析（ModFIT）,细胞凋亡的分析,细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程 细胞凋亡的