载体的构建 Construction of vector.ppt

1、载体的组成构造，转基因技术的一般实验过程，载体的功能和特性，载体：将外源DNA转移到宿主细胞的工具。1.载体的功能1。将外原油电子高效转移到受体细胞。2.为外原油电子提供复制力或整合能力。3.为外原油电子的放大或表达提供条件。2.载体必须具备的条件1。对受体细胞的转移性2。有适合特定受体细胞的复制部位或整合部位。3.长度尽可能小。提高装载能力。4.多种单一酶切点5。适当的选择性标记，植物遗传工程载体，复制载体中间复制载体中间复制载体中间表达载体植物遗传工程载体载体载体载体，转换载体，一元转换载体，二元转换载体，KpnI，BamHI 33方法碱分解法、溴B-氯氟化碳密度索氏离心法、DNA质粒释放

2、法、羧基柱层析法、山梨醇法。分离质粒DNA的方法通常由三个基本阶段组成。培养细菌，放大质粒。收集和分解细菌。质粒DNA的分离纯化。碱分解法，在pH12.012.5的碱性条件下加热，DNA互补链之间的氢键断裂，但由于ccDNA双螺旋主链骨架的相互线圈作用，互补的两条链仍然紧密结合。相反，线性DNA的两条链是完全分离的。碱分解法提取质粒DNA，1，培养细菌将带pKANNIBAL的大肠杆菌接种到含有10ml卡那霉素的LB培养液中，37摇床培养12h。2、细菌的收集和分解(1)将1.5毫升的菌液导入Eppendorf小型离心管，4，12000rpm离心1-2min，放弃听力。(2)加入100ul预冷溶

3、液I，充分混合后吹。溶液I: 50mmol/l葡萄糖25 mmol/ltris-cl(ph=8.0)10 mmol/ledta(ph=8.0)注：溶液I需要15min高压蒸汽灭菌，存储在4中(盖上盖子后，迅速翻转5号，混合内容物，不要震动。溶液：0.2mol/lNaOH(目前用任用前10mol/l储液稀释)1%SDS，(4)加入150ul冰预冷溶液，轻轻搅拌，冰浴10min。12000rpm离心10min，将上清移至其他新离心管。溶液：5毫升/l醋酸钾60毫升冰醋酸11.5毫升水28.5毫升(5)等体积苯酚：氯仿，充分混合。12000rpm离心10min，吸入。(6)加入体积为0.8 1倍的异

4、丙醇，加入-20，10分钟。12000rpm离心10min，放弃听力。(7)加入70%乙醇300-400ul。12000rpm离心5min，放弃听力。(8)洗净，加入20ul无菌水或TE缓冲液溶解。(9)电泳检测。大肠杆菌感受性细胞的制备、重组质粒的转化及克隆的筛选和鉴定、鉴定细胞(Cacl2、Rucl等化学试剂法等特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了变化，可以容纳很多外源DL。大肠杆菌DH5感觉细胞的制备，(1)在新激活的E.coil DH5版中选择1个单细胞(或减胎细胞)，接种到10mlLB液体培养基中，在37振动下过夜，培养160170rpm。(2)将1ml菌液输送到100mlLB液体培

5、养基，37振动扩大2h，形成OD6000.5。(3)将100毫升菌液转移到2个50毫升离心管，冰浴30-40min，5,000rpm8min，放弃听力。(4)用冷0.1mol/LCacl2，1/10V(5ml)放入沉淀物，冰浴20min，5，000rpm7min，回收细胞，在冰浴中使用1/20V冷0.1 mom(5)转换：将异种DNA分子引入细胞株系，使受体细胞获得新的遗传特性的手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。重组质粒转化，转化方法，1，化学方法(热击法)；使用CaCl等化学试剂准备的感应细胞通过热冲击处理将载体DNA分子引入受体细胞。2.电转化法：利用低盐缓冲液或水洗准备的感应细胞

6、，通过高压脉冲的作用，将载体DNA分子引入受体细胞。重组质粒转化(热休克法)，1，冰融化敏感细胞；2，10ul连接产物为100ul感应细胞，冰浴40min放入。3，42热冲击90s，不要摇晃！4、热冲击后立即放置冰1-2分钟；5，添加400ulLB液体培养基，安装摇床，37，70-100 rpm 1H；6、擦平板电脑。克隆筛选和鉴定，多种抗生素基因筛选中常用的抗生素有氨苄西林、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。要在选择性培养基中培养转化的细胞，才能很容易地筛选出转化体，即含有二元DNA分子的受体细胞。否则，如果将转换后的菌液涂抹在没有选择抗生素的培养基上，就会产生成千上万的细菌，很难确定哪些

7、克隆中含有转换后的粒子。只有包含转基因质粒的细菌才能在含有抗生素的板块上生长和繁殖，但对于连接混合物，包含插入片段的克隆不确定。反乳糖酶系统筛选(蓝/白半病筛选)，-互补现象：在很多载体上，反乳糖酶(LacZ)基因的调节序列和前146个氨基酸的编码信息，编码-补补补补补补品，宿主编码缺陷型-反乳糖酶共同实现基因内的补充当这个矢量转移到可以编码反乳糖酶C端序列的宿主细胞时，根据异丙基-D硫代反乳糖(IPTG)的诱导，宿主可以同时合成这两个片段。虽然各没有酶活性，但它们可以融合成一个，形成具有酶活性的蛋白质。(阿尔伯特爱因斯坦，北境外，成功)所以这种现象被称为-互补现象。通过互补产生的半乳糖苷(LacZ)可以作用于生色基质5溴4氯3吲哚d半乳糖苷(X-gal)，从而产生蓝色菌落，因此，利用此特性在载体的基因编码序列之间手动放置多个复制部位，插入外源DNA片段时，LacZ(因此具有重组质粒的菌落是白色的)，将重组质粒转化为大肠杆菌的过程示意图