精品]分子荧光分析法

1、第五章分子荧光分析法、荧光自然段中存在这样的物质，如果吸收外界的能量，就会发出与不同波长不同强度的光，外界的能量一旦消失，该光也会消失。 这种光叫做荧光。 从外部供给能量的方式有光照射、加热、化学反应、生物代谢等各种方式。 由光的激发产生的荧光称为光致发光。 根据激发光的波长，荧光可以分为放射性射线荧光、紫外可见荧光、红外荧光等。 根据发出荧光的粒子，荧光分为分子荧光和原子荧光。 因物质不同，其组成和结构也不同，所吸收的光的波长和发出的光的波长也不同，利用这个特性可以进行物质的定性鉴别。 该物质的浓度不同时，发光的荧光强度不同，可以测定物质的荧光强度进行定量测定。 荧光分析法是利用物质的荧光特

2、征和强度，进行物质定性和量化分析的方法。 荧光分析法的特点是灵敏度高、选择性好、样品用量少、操作简便。 其灵敏度通常比分光光度法高23位数。 在卫生检查、环境及食品分析、药物分析、生化和临床检查等方面应用广泛。 第一节的基本原理，一、荧光的产生，物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和旋转能级。 分子吸收能量后，从基态的最低振动能级向第一电子激发态或更高级电子激发态的不同振动能级(该过程速度快，约10-15 s )迁移，激发单线态分子。 激发态分子不稳定，可以通过以下几种方法释放能量回到基态。 1 .振动弛豫这一过程是指在同一电子能级内，即分子因碰撞而热损失一部分能量，只能从高振动动能级发

3、生到该电子能级的最低振动能级。 这个能量的一部分不是作为光放射，而是作为热放出，所以振动缓和是无放射迁移。 2 .内变换即激发态分子将多能量转换为热能，从高电子能级下降到低电子能级。 内部变换也是无辐射转变。 3 .荧光高的激发态分子由于无辐射跃迁下降到第一电子激发单重态的最低振动能级后，仍不稳定，在短时间停留后(约10-8 s，称为荧光寿命)，以光辐射的形式释放能量，返回基态的各振动能级。 此时发出的光称为荧光。 当然，也可以不用辐射转变就回到基态。 4、系间窜漏瓦斯气体的一些物质的激发态分子由于振动弛豫和内转换下降到第一电子激发态的最低振动能级并有可能经由另一个无辐射迁移转移到激发三重态，

4、该过程伴随有大头针方向的变化，被称为系间窜漏瓦斯气体. 在大多数物质中，系间跳跃是被禁止的。 分子中存在重原子(例如I、Br等)时，通过大头针轨道的强耦合作用，可以改变电子的大头针方向，系统间的窜漏瓦斯气体变得容易。 5 .磷光经系统间的broby瓦斯气体分子由于振动缓和而下降到激发三重态的最低振动能级，在有会儿滞留(10-410 s，称为磷光寿命)，然后以光放射的形式放出能量返回到基态的各振动能级，此时发出的光称为磷光(phosphorescence )。 由于激发的三重态能量低于激发的单重态最低振动态能量，磷光放射的能量小于荧光，也就是磷光的波长长于荧光。 二、激发光谱和荧光色光谱；(一)

5、荧光检测，光源发出的紫外可见光根据激发单色器分离不同波长的激发光，照射样品溶液，激发样品产生荧光。 来自样本的荧光是宽带光谱，并且必须在对单色器进行分光之后进入检测器，以检测在不同发光波长的荧光强度f。 由于激发光不能完全被吸收，所以可以透过溶液，为了防止透过光对荧光测量的干扰作用，大多在与激发光垂直的方向上检测荧光(因为荧光向所有方向放射)。(二)激发光谱和荧光色光谱的形成，任何荧光物质都有激发光谱和荧光发射色光谱的两个特征光谱。主要是荧光光谱。 1 .保持所激发光谱的荧光发射波长(即，固定发射单色器)，并顺序改变激发光波长(即，调节激发单色器)，并且测量从具有不同波长的激发光所获得的荧光强

6、度f (即，激发光波长扫描)。 当激励光的波长绘制在横轴上，荧光强度f绘制在纵轴上时，得到该荧光物质的激发光谱。 与激发光谱上荧光强度的最大值对应的波长是最大激发波长，激发荧光是最敏锐的波长。 物质的激发光谱与其吸收谱相似，但纵轴不同。 2 .荧光色光谱荧光色光谱，也称为发光色光谱。 直接改变激发光的波长(即固定激发单色器)，依次改变荧光发光波长，测定试料以不同波长发光的荧光强度f。 绘制发光波长为横坐标，荧光强度f为纵坐标，得到荧光发光色光谱。 与荧光发光色光谱中荧光强度的最大值对应的波长是最大发光波长。 (3)荧光色光谱和激发光谱的关系，1 .荧光色光谱形状与激发光波长无关，由于荧光是分子

7、从第一电子激发状态的最低振动能级返回到基态的各振动能级时发出的光放射，因此与分子被哪个电子激发状态无关。 2 .荧光色光谱比通过激发光谱波长较长的分子吸收激发光激发为高激发状态后，先通过无辐射迁移(振动弛豫、内转换)失去一部分能量，达到第一电子激发状态的最低振动能级，由此发出荧光。 因此，荧光发光能量比激发光能量低，荧光色光谱的波长比激发光波长长。 3 .镜像对称相对于高度对称的有机分子，荧光色光谱和吸收谱呈镜像对称的关系。 说明1 :能级结构相似性荧光是第一电子激发单重态的最低振动能级向基态的各振动能级迁移形成的，其形状与基态振动能级分布有关。 激发光谱是基底状态的最低振动能级向第一电子激励

8、单重态的各振动能级迁移而形成的，其形状与第一电子激励单重态的振动能级分布有关。 激发态和基态的振动能级分布因为相似性而镜像对称。 三、影响荧光产生及荧光强度的因素，(一)物质产生荧光的必要条件，一种物质能否产生荧光及荧光强度的高低，与其分子结构及场所环境密切相关。 所有能发荧光的物质对云同步都必须具备两个条件：1.物质分子需要强的紫外吸收(*迁移)，2 .物质具有高荧光效率(fluorescence efficiency )。 荧光效率也称为荧光量子产率，用f表示。 研究表明，增加kF、降低其他失活常数的因素均能够增加荧光量子产率。 通常，kF由分子结构(内因)确定，其它残奥仪由化学环境和结构

9、确定。 (2)荧光及影响其强度的因素。 转变类型：如上所述，为了产生荧光，紫外可见区域需要强吸收和高荧光效率。 有迁移的分子有很强的吸收。 迁移的大小。 共轭效应：能产生荧光的物质大多含有芳香环或杂环，具有共轭*迁移。 其共轭度越大荧光效率也越大，最大激发发光波长像苯、萘、蒽3种物质那样在长波长方向上移动。 刚性平面结构：荧光分子的共轭程度相同，分子的刚性和共面性越大，荧光效率越大。 有些物质本身会发出荧光或荧光弱，与金属络离子形成配合物后，刚性和共面增加，可以发出荧光或增强荧光。 例如8 -喹啉醇是弱荧光物质，利用与Mg2、Al3等金属络离子的络合物的荧光增强，可以间接地测定金属络离子。 取

10、代化学基荧光分子上的各种取代化学基对分子的荧光色光谱和荧光强度有很大影响。NH2、OH、OCH3、CN、NHR、NR2等供电子取代化学基可以增加分子的电子共轭度，提高荧光效率。 另一方面，-COOH、NO2、C=O、f、Cl等吸电子置换化学基可以减弱分子电子的共轭性，减弱或熄灭荧光。 另一种置换化学基对荧光的影响不明显，如r、SO3H、NH3等。 温度对被测溶液的荧光强度有显着影响。 温度上升时，介质黏性系数减少，分子运动加快，分子间碰撞概率增加，分子的无辐射迁移增加，荧光效率降低。 降低温度有利于提高荧光效率和荧光强度。 由于荧光机器光源的光强度大，温度高，容易引起溶液温度的上升，分析中室温

11、变化，荧光强度可能变化。 另外，根据荧光物质的溶液，如果长时间照射激发光，则会发生光分解，荧光强度有时会降低。 因此，试料不应长时间受光照射，仅在测量荧光强度时打开快门优先，其佝偻时间必须关闭。 在高级荧光分光光度修正中，在试料室的周围设置冷却水茄克衫或恒温装置，使溶液的温度在测定中保持一定。 溶剂：相同的荧光物质在不同的溶剂中，其荧光色光谱的位置和荧光强度可能有一定的差异。 特别是在这些分子中含有极性取代化学基的荧光物质，它们的荧光色光谱容易受到溶剂的影响。 溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。 一般的溶剂效果是指溶剂极性的影响。 通常，随着溶剂极性变大，*迁移所需的能量差e变小，跃

12、迁几率增加，荧光波长变长，荧光强度增大。 特殊溶剂效应是指溶剂和荧光物质形成化合物，溶剂改变荧光物质的电离状态，使荧光峰值的波长和荧光强度发生很大变化。 在萘胺的乙醇溶液中加入盐酸后，随着溶液中盐酸浓度的增加，萘胺的NH2化学基被NH3Cl化学基取代，NH3Cl化学基对萘环特征频率的影响小于NH2，因此溶液的荧光色光谱接近萘的荧光色光谱。 pH值：溶液的酸度(pH值)对荧光物质的影响可以分为两个方面： 1荧光物质本身是弱酸性或弱碱性时，溶液的pH值发生变化，物质分子与其络离子的平衡也发生变化，而不同的体分别具有特定的荧光色光谱和荧光效率。 例如，在苯胺、2 .金属络离子和有机试剂生成的荧光络合

13、物中，溶液的pH的变化影响络合物的组成，影响它们的荧光特性。 例如，Ga3络离子和邻二羟基偶氮苯在pH34的溶液中形成1:1络合物，可以产生荧光。 在pH67的溶液中，形成12个配合物，不产生荧光。 总之，溶液的pH值影响荧光物质的荧光色光谱、荧光效率和荧光强度。 在条件实验中发现pH与荧光强度的关系，为提高分析的灵敏度和精准性有必要确定最合适的pH范围。 由于荧光熄灭荧光物质的分子间或与其他物质的相互作用，荧光强度显着降低的现象称为荧光熄灭或消光。 引起荧光的熄灭的物质被称为卤素络离子、重金属络离子、氧分子、硝基化合物、二偶氮化物、羧基化合物等的荧光熄灭剂。 荧光熄灭的原因有多种多样： (1

14、)激发状态的荧光分子与灭火剂分子碰撞，将能量转移到灭火剂中来熄灭荧光；(2)通过荧光分子与灭火剂分子的作用，自身生成发光配合物溶液浓度越高自灭现象越严重(5)溶解于溶液中的氧分子几乎所有荧光物质都会引起不同程度的荧光灭灯。 荧光灯是荧光分析的不利因素。但是，如果某荧光物质在加入某个灭火剂后，荧光强度的减少与灭火剂的浓度呈直线关系，则可以利用该性质建立灭火剂的荧光分析法，称为荧光熄灭法。 荧光熄灭法比直接荧光法敏锐、有选择性。 例如，铝桑色素络合物的荧光强度由于微量的氟络离子的存在而引起荧光消失，可以利用该性质测定试样中微量的氟络离子的含量，此时溶液的荧光强度与氟络离子浓度成反比。 散射光(sc

15、attering light )是一种光照射到被测溶液，其中的一部分光被吸收而发出荧光，一部分光透过溶液，一部分光因光子和溶剂分子的碰撞而使光子的运动方向发生变化，向不同的方向散射，称为散射光。 1 .瑞利(Reyleigh )散射光光子与物质分子发生弹性碰撞，使能量不发生交换，只是光子的运动方向发生变化，其波长和激发光相同，因此将该散射光称为瑞利散射光。 其强度与波长的四次方成反比，即波长越短，瑞利散射越强。 但是，瑞穗散射光的波长与激发光的波长相同，选择适当的荧光测量波长或选择过滤烟嘴即可消除其影响。 2 .受激喇曼散射光子和溶剂分子非弹性碰撞，运动方向变化时，在云同步中，光子和溶剂分子发

16、生能量交换，使光子能量减少或增加，光的波长增加或缩短，两散射光都称为拉曼(散射)光。 其中波长长的拉曼光，因为其波长接近物质的荧光波长，所以对测量的干扰作用大。 拉曼光的波长根据激发光的波长而变化，但荧光物质的荧光波长与激发光的波长无关，因此通过选择适当的激发光的波长，能够区分两者。散射光谱、散射光谱、第二节定性量化分析、一、荧光强度与溶液浓度的关系、分光光度法测定物质对光的吸收程度的荧光分析法是测定物质吸收一定频率的光后，物质自身发出的荧光强度。 溶液中的荧光物质被入射光激发时，可以在各个方向观察到荧光，但是激发光的一部分会透过溶液，因此在透射光方向观察荧光是不合适的，一般在与透射光垂直的方

17、向观察荧光。 测量荧光强度时，选择两个不同的波长。 一种是物质吸收的光，即激发光的波长；另一种是被激发的物质发出的光，即荧光的波长。 溶液的荧光强度与该溶液对光的吸收程度及溶液中荧光物质的荧光效率有关。 根据Beer定律，溶液的荧光强度与溶液的光吸收的程度和荧光效率成比例，即，在abc0.05 (即，溶液薄)的情况下，对于给定的荧光物质测量条件是给定的，即，给定的荧光物质的稀溶液(abc0.05 )，这是荧光分析的定量基础。 二、定性分析、荧光物质的特征光谱包含激发光谱和荧光色光谱，因此用它鉴定物质比吸收谱更可靠。 您可以选择这样的格式：您可以选择这样的格式：您可以选择这样的格式。 第三节设备

18、、一、设备的结构和原理、设备类型很多，基本结构类似，一般包括激励光源、单色器、样品单元、检测器和记录显示部分五个部分。 1 .光源能够发出从紫外到可见区域的波长的光，强度大，稳定。 常用的是元素溴钨丝灯，高压水银灯，氙灯泡。 2 .单色器2个单色器，3 .样品池通常为灰水晶制，4 .检测器光电子倍增管，2，仪器类型1 .光电荧光校正用过滤烟嘴为单色器(激励过滤烟嘴和荧光滤镜)，溴化钨丝灯，或高压水银灯为检具。 2 .荧光光谱光度校正以氙灯泡为光源，以光栅为单色器，光电子倍增管为检测器。可以连续地扫描激发光谱和荧光色光谱。 第五节荧光分析法的应用，(1)有机物的荧光分析，由于其荧光分析的高灵敏度、高选择性，将在医学