全血DNA的提取及电泳

1、dna的提取及电泳,2013.03.30,生物化学与分子生物学,1.实 验 原 理,dna,一、全血dna的提取,由于血液各组分成分颗粒大小及比重不同，利用明胶的吸附作用，使红细胞沉积在管底，从而与白细胞相分离。 通过sds的破膜（细胞膜和核膜）作用，使白细胞释放出dna。 然后利用酚和氯仿抽提纯化，分离去除蛋白质。 最后用乙醇沉淀洗出dna。,2.材料与方法,.材料 用含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有edta和肝素，edta更好一些，不会影响下游的反应。 每5ml的血液中加入0.4ml 0.04m edta配好的edta溶液，颠倒混匀即可。 保存于-20至-80，最好在2个月内提取。,

2、3%明胶，tes， tris饱和酚（ph7.8），氯仿：异戊醇（24:1），无水乙醇，te 离心机，7ml离心管，1.5mlep管，中试管，移液器,方法：, 提取wbc,37静置，510min,3000r/min 离心 ，5min,溶液颜色均一,溶液颜色 上下分层,沉淀颜色为 红色, 破碎wbc,加入2ml tes,加10滴10%sds,轻轻敲击管底震荡混匀,颠倒混匀,溶液全部变为 粉红色,溶液颜色变暗, 抽提dna,加等体积 tris饱和酚,颠倒混匀，50次， 3000rpm，离心5min,取下层酚溶液，混匀后溶液变为均一的棕色,取上清,加等体积氯仿：异戊醇（24:1）,将上清移入试管,颠倒

3、混匀，50次 3000rpm，离心5min,混匀后溶液变为均一的乳白色, 沉淀dna,加2.5倍 无水乙醇,吸出絮状沉淀到1.5mlep管,挥干至 无色液体,通风橱内放置5min,加入100 ddh2o溶解,缓慢加入后，上下均为无色，但有分层面；吸取上层乙醇，轻轻吹打下层（油状）混匀。 无水乙醇与水溶液交界面特点： 1.气泡 2.白色絮状沉淀,二、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定以及纯化dna或者rna分子的方法。 这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用dna分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。,1.原理,电泳介质,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，是由

4、d型和l型半乳糖以-1，3和-1，4糖苷键相连形成的线状高聚物。沸水中溶解，45 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小（孔径范围从50nm到大于200nm）决定于琼脂糖的浓度。,.dna分子的电荷效应：,dna在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。 dna带净电荷量的多少与电流强度，电泳缓冲液的ph值和离子强度有关。,. dna琼脂糖电泳的分子筛效应：,在一定的电场强度下，dna分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小、构型和琼脂糖的浓度是主要的影响因素。,dna分子的迁移速度与其相对分子量成反比。,m 1 2 3 4 5,琼脂糖的浓度,示踪染料： 有致癌性: eb，吖啶

5、橙等; 无毒的染料：goldview i核酸染料等,.示踪染料和分子量标准参照物,eb,goldview, 分子量标准参照物（marker）,实验材料： 全血基因组总dna .实验试剂： 琼脂糖 5tae电泳缓冲液 6电泳载样缓冲液（ 6 loading dye）： 0.25 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青，40(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4。 goldview i型核酸染料： 每10 l dna加入2 l染料。,3. 实验材料和试剂,.实验仪器,凝胶成像系统,4. 操作步骤,.制胶 1.0% 琼脂糖凝胶，0.5tbe .上样 上样缓冲液 .电泳 100v，20min .观察 紫外灯下观察,溶 胶,上样准备,分别吸取上述体积的dna和6loading dye，至透明胶布的光滑表面，用移液器吹打均一。,凝胶冷却至50，加goldview i 2 l摇匀,凝胶凝固后取出梳子,加缓冲液,准备样品,点 样,电 泳,注意观察溴酚蓝染液的迁移,紫外灯下观察电泳结果,照 相,制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀；速