微生物基本试验原理及操作

1、微生物基本试验原理和操作、微生物基本试验、碳源和氮源利用试验碳水化合物的代谢试验各种酶体系试验氨基酸和蛋白质代谢试验、碳源和氮源利用试验、柠檬酸盐试验葡糖酸盐试验、柠檬酸盐试验、原理：有些细菌以柠檬酸盐为唯一的碳源，利用柠檬酸钠分解生成碳酸钠金属钍，使培养基呈碱性。 可将柠檬酸盐作为唯一碳源的细菌，也可将铵盐作为唯一的氮气源，铵盐分解为阿摩尼亚产生碱性。 西门氏柠檬酸盐培养基成分，mgso4-7h2o0.2gn h4h2po 41 GK2hpo 41 g柠檬酸钠5g氯化纳金属钍5g琼脂20g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液40ml蒸馏水1000ml，结果：阳性者表面发生菌落，培养基呈蓝色。葡糖酸盐试

2、验、原理：检测细菌是否具有氧化葡萄糖作为唯一的碳源，并具有将2-酮葡糖酸盐和苯试剂混合加热生成黄红色酮类的能力。 方法：将大量被检菌接种培养基内，35，24-48小时，培养基加班试剂0.5ml滴左右，加热煮沸后观察结果。葡糖酸盐蛋白胨肉汤成分、蛋白胨0.15g酵母精0.1g磷酸二氢钾元素0.1g葡糖酸钾(或纳金属钍) 4g蒸馏水100ml，结果：黄色至橙色沉淀阳性、无色变化阴性。 碳水化合物的代谢试验，氧化发酵试验(OF试验)糖酒精发酵试验b半乳糖苷酶试验(ONPG试验)甲基红试验VP试验胆汁七叶氰苷类试验，氧化发酵试验(OF试验)，原理：细菌分解葡萄糖的过程中，在分子氧必须参加的被称为缺氧条

3、件下，将葡萄糖分解的发酵型可以利用这个实验区分细菌的代谢类型。 培养高松戴奥辛培养基(O-F培养基)成分、蛋白酶2g磷酸氢2钾元素0.3氯化纳金属钍5g葡萄糖10g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液12ml琼脂2.5g蒸馏水1000ml、方法：将被检菌接种2根高松中35、48小时的观察结果。 培养基的颜色变黄会产生酸。 结果表明，代谢型加蜡封口管开放管发酵型产酸不变色产酸不变色碱型糖酒精发酵试验、原理：各细菌含有发酵不同的糖、醇类酶催化剂，因此分解糖、醇类的能力不同。 分解砂糖和酒精类物质后产生的代谢产物因菌种不同而不同，有酸和瓦斯气体发生剂，因为只产生酸，用于细菌的鉴别。糖、醇类试验培养基成分、蛋白

4、胨水或肉汤100ml所需的糖、酒精或氰苷类0.5或1g 1.6%溴甲基酚紫乙醇溶液0.1ml，结果，如果接种细菌能够分解培养基中的糖类的酸生成，则使培养基中的指示剂进行酸性反应。 如果瓦斯气体发生剂能够在半固体培养基内或液体培养基中的逆管内产生气泡的话。 不分解就没有变化。 b半乳糖苷酶试验(ONPG试验)，原理：某些细菌能产生b半乳糖苷酶，该酶催化剂能分解邻硝基酚-B-D-半乳糖苷酶(ONPG )。 ONPG为无色，用b半乳糖苷酶水解作用时会产生黄色的邻硝基酚，即使浓度低也能检测出来。 其结果，黄色表示呈阳性。 快速延缓乳糖分解的细菌ONPG试验为阳性，本试验可作为延缓发酵乳糖菌株的快速鉴定

5、方法。甲基红试验、原理：部分细菌在糖代谢过程中，将葡萄糖分解生成焦磷酸，再将焦磷酸分解成甲酸、冰乙酸、乳酸等，将培养基pH降低到4.5以下，再加入甲基红指示剂变成红色(阳性)。 甲基红试验、原理：当一些细菌分解葡萄糖产生酸的量少，或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醛、瓦斯气体和水)时，培养基的酸盐基度仍在6.2以上，加入甲基红指示剂后变为黄色(阴性)。、葡萄糖蛋白胨水培养基成分、多元蛋白胨7g葡萄糖5g磷酸氢二钾元素5g蒸馏水1000ml，方法：将被检菌接种上述培养基内，用35培养48小时，在2ml培养液内加入甲基红指示剂2滴，立即观察结果。 结果：红色为阳性橘红色弱阳性，黄色为阴性。

6、VP试验、原理：有些细菌在葡萄糖代谢过程中生成焦磷酸，焦磷酸经一头地脱羧后生成乙酰甲基甲醇。 乙酰甲基甲醇在碱溶液中被空气的氧氧化为二乙酰(丁基二酮)，进而与培养基内的蛋白胨中的精氨酸中含有的胍化学基反应，生成红色化合物VP反应阳性。 培养基中的胍化学基过少时，通过少量添加含有肌酸酐、肌酸酐等胍化学基的化合物，可加速该反应。 试剂：甲液：6%a-萘酚乙醇溶液乙液： 40%氢氧化钾元素溶液，方法：将被检菌接种葡萄糖蛋白胨水培养基后，用35培养48小时，在2ml培养基中加入1ml甲液和0.4ml乙液，摇匀观察结果，结果：数分钟内呈红色，呈阳性红色本试验比较敏感。 胆汁七叶氰苷类试验，原理：在10-

7、14%胆汁存在下，测定细菌将葡萄糖苷七叶氰苷类水解作用到七叶亭和葡萄糖中的能力。 胆汁七叶氰苷类培养基成分，蛋白胨5g牛肉汁3g牛胆汁(胆汁) 40g七叶氰苷类1g柠檬酸铁元素0.5g琼脂15g蒸馏水1000ml，结果：培养基呈黑色或深褐色成为阳性。 在活着的期间，并不是表示肌苷开裂，而是表示仅靠胆汁浓度不能抑制d群链球菌以外的细菌的生长。各种酶催化剂类试验、过氧化氢酶(触酶催化剂)试验、氧化酶催化剂试验、血浆凝固酶催化剂试验、硝酸盐还原试验、胆汁溶解试验、腺嘌呤核苷酸(cAMP )试验、过氧化氢酶(触酶)试验，原理：有些细菌具有过氧化氢酶，可以将过氧化氢酶分解为水。 试剂：3%过氧化水素水。

8、 方法：玻璃片法：用牙签抽取培养1824小时的菌苔，置于清洁玻璃片上，滴加3%过氧化水素水12滴。 试管法：将不含血液的1824小时培养物接种试管内，加入3%过氧化水素水1ml。 3%过氧化水素水应放入茶色瓶中冷藏。 结果：大量气泡发生为阳性，气泡发生为阴性。 血浆凝固酶催化剂试验、原理：凝固酶催化剂是凝固血浆血纤蛋白、鉴定金黄色葡萄球菌的主要试验。 本试验分为玻璃板法和试管法，玻璃板法主要是为了检测结合凝固酶催化剂，试管法肯定了玻璃板法的试验结果，探讨玻璃板法的试验阴性者，检测游离凝固酶催化剂。 血浆凝固酶催化剂试验、原理：结合凝固酶催化剂含于金黄色葡萄球菌细胞球的表面，游离凝固酶催化剂为金

9、黄色葡萄球菌所产生的胞外酶，两酶催化剂均被用作血浆中的纤维蛋白原，转化为纤维蛋白，形成凝固块。 方法：玻璃板法：在玻璃板里加入一滴灭菌生理盐溶液，取葡萄球菌18-24小时肉汤培养物的一环，或取平板上的每个菌落，制成浓菌混悬剂，并加入一种环新鲜人、兔血浆和菌混悬剂混合。 云同步阳性菌和阴性菌对照试验，立即观察凝固块的形成。 本试验应先乳化于生理盐溶液，检查有无自凝现象。 防止假阳性的结果。 一般认为，阳性结果在520秒以内出现，34分钟后如果不凝固，则为玻璃板法试验阴性。 试管法：在干净的小试管中加入未稀释的人和兔子的血浆0.5ml，加入培养了18-24小时的葡萄球菌肉汤培养物0.5ml，或者取

10、出平板上的纯菌落，轻轻旋转试管进行混合。 在35水浴中放入4小时，每隔30分钟检查有无凝固。 检查时不要使试管振动或摇晃，可轻轻倾斜试管观察有无凝块。 多数金黄色葡萄球菌株在354小时内可凝固血浆，呈阴性对照。 枸木酸盐抗凝血血浆能产生假阳性结果。氧化酶催化剂试验、原理：部分细菌具有氧化酶催化剂，当有氧和细胞色素c时，氧化还原型细胞色素c，氧化型细胞色素c进一步氧化二甲基乌尔兹，从玫瑰红变成暗紫色。 有时蚁群本身带有红色难以观察，再加入a -萘酚乙醇溶液可以生成藏蓝色的靛酚蓝。 试剂：取1%盐酸二甲基乌尔兹(或四甲乌尔兹)水溶液2 1%a-萘酚95%乙醇溶液，方法：取18-28小时新鲜培养物，

11、在无菌滤纸条上少许浸泡菌落，滴加1%，结果1分钟内出现紫红色，阳性。 菌落本身如果有色素，再滴入12滴a -刀酚，出现蓝色就成为阳性。 硝酸盐还原试验、原理：硝酸盐还原反应包括将硝酸盐还原成亚硝酸盐的过程，和把亚硝酸盐进一步分解成阿摩尼亚、氮、氧化氮等瓦斯气体最终产物的过程。 硝酸盐还原试验培养基成分、蛋白胨1g硝酸钾0.1g蒸馏水100ml，方法：将被检菌接种硝酸盐培养基中，在35培养14天内，在试管内各加入0.1ml甲、乙试剂，将观察结果混合后，发现红色为阳性。 如果没有出现红色，就必须添加少量的锌粉，如果还没有红色，亚硝酸盐就会进一步分解成氮、阿摩尼亚等瓦斯气体，如果添加被判断为阳性的锌

12、粉而变成红色，则还原剂锌粉将硝酸盐还原成亚硝酸盐，显示出受检菌没有将硝酸盐还原的能力，呈阴性。 胆汁溶解试验、原理：在特定的时间和温度条件下测定胆盐溶解细菌的能力。 溶菌的反应历程尚不明确，认为胆盐和胆汁将激活肺炎链球菌的自溶酶催化剂，溶解菌体。 试剂： 10%脱氧胆酸钠金属钍溶液或牛胆汁，平板法： 10%脱氧胆酸钠金属钍溶液一接种环，加血琼脂平板试验菌落，放置35个培育箱30分钟，肺炎链球菌集群成为阳性。 阴性者的菌落还存在。 环腺嘌呤核苷酸(cAMP )试验原理： b群链球菌(无乳链球菌)在羊血或牛血培养基上与金黄色葡萄球菌溶血素协同作用，产生促进溶血素活性的因子(cAMP因子)。 因此，

13、在两细菌的边界溶血力增加，出现了箭头形溶血区。 方法：先将金黄色葡萄球菌(药剂易感性特罗尔菌)接种羊血平板，然后垂直地短接种待检菌和金黄色葡萄球菌接种线，两者不能交叉，距离3mm左右，在云同步待检菌接种线的相反侧，用同样方法接种阴性和对照菌，用35培养一晚， 如放入CO2烛筒内较好，结果：被检菌接种管线和金黄色葡萄球菌接种管线出现矢状强化溶血区，为CAMP阳性。 阴性未强化溶血区。 氨基酸和蛋白质代谢试验、吲哚试验硫化氢试验苯丙氨酸脱阿摩尼亚酶催化剂试验氨基酸脱阿摩尼亚酶催化剂试验动物胶液化试验、吲哚试验、原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚(印度基质)，与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛发生作

14、用， 生成玫瑰吲哚呈红色的蛋白酶水培养基成分、蛋白酶(或胰蛋白酶) 10-20g氯化纳金属钍5g蒸馏水1000ml、kovac试剂对二甲氨基苯甲醛10g纯磨粉机醇150ml纯浓盐酸50ml先将试剂溶解于醇中方法：选择纯培养物接种蛋白胨水培养基，用35培养12天，沿管壁缓缓加入0.5 ml kovac试剂制成2层，观察结果。 结果：两者液面边界出现红色为阳性，无色阴性。 硫化氢试验、原理：细菌分解培养基中的含硫氨基酸(如半胱氨酸、半胱氨酸)和含硫化物生成硫化氢，而硫化氢遇到金属铅和铁元素络离子生成黑色硫化物。 由此间接地检测细菌是否产生硫化氢。 培养基：三糖铁元素培养基或克二糖铁元素培养基，结果

15、：培养基黑为阳性，无变化为阴性。苯丙氨酸解阿摩尼亚酶催化剂试验、原理：细菌产生苯丙氨酸解阿摩尼亚酶催化剂，苯丙氨酸脱氨基化生成苯丙氨酸注音字酸，苯丙氨酸与铁元素离子作用生成绿色配合物。 苯丙氨酸培养基成分、DL苯丙氨酸0.2g(L苯丙氨酸0.1g )酵母精0.3g氯化纳金属钍0.5g琼脂0.1g琼脂1.2g蒸馏水100ml、试剂： 10%三氯化铁元素溶液10g可溶解于蒸馏水100ml中。 方法：将被检菌接种培养基斜面，35培养24小时，滴加氯化第二铁元素试剂，观察结果。 结果培养基斜面绿色呈阳性，不变色呈阴性。 氨基酸脱碳酸酶催化剂试验(赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸)、原理：细菌使氨基酸脱羧基化学基

16、，生成胺系化合物，检测使培养基碱化的能力。氨基酸脱碳酸酶催化剂基础培养基成分、蛋白胨5g酵母精3g葡萄糖1g 6%溴甲基酚紫萃取溶液1ml蒸馏水1000ml将上述成分溶解于蒸馏水之后，加入必要的氨基酸(赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸)，使其浓度为。 对照管不加氨基酸。 方法：取被检菌接种氨基酸脱羧培养基和对照管，封入流动残奥蜡，培养24小时以上的观察结果。 注意事项、培养基的pH值应为偏酸，有利于酶催化剂的形成。 封入流动残奥鳍引起厌氧环境，在厌氧环境下氨基酸脱羧而生成的胺稳定，还可以避免假阳性。 对照管不变色就无法判断结果。 结果：接种被检菌测定的培养基为紫色，对照管为黄色为阳性，两管均为黄色阴性。 乌土卫五酶试验，原理：某些细菌能产生乌土卫五酶。 乌土卫五酶可以分解尿素，尿素分解后产生大量的阿摩尼亚，使培养基碱化。尿素培养基成分、鸡蛋清蛋白胨1g氯化纳金属钍5g葡萄糖1g KH2PO4 2g 20%尿素水溶液100ml琼脂15g 0.1%酚红水溶液12ml蒸馏水900ml，方法：将被检菌接种尿素培养基后，放置35培养18-24小时观察结果。 阴性应观察4天。 结果：细菌降解尿素后培养基呈红色阳性，不阴性。 动物胶液化试验、原理：明胶酶是细菌产生的胞外酶，可将动物胶分解成氨基酸，丧失凝固力，使半固体动物胶培养基成为液体。 动物胶培养基的制法通常可以在琼脂中加入1%的动物胶。