DNA提取原理和方法PPT课件

1、DNA提取方法介绍，DNA提取的几种方法，基因组DNA提取，CTAB SDS法等，DNA提取的几种方法，非基因组DNA提取，质粒DNA提取，碱溶煮沸，线粒体和叶绿体DNA提取，差速离心结合SDS裂解，基因组DNA CTA等。CTAB法(植物DNA提取的经典方法)的原理是CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，它是一种阳离子洗涤剂，能溶解细胞膜并与核酸形成复合物。它具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多糖的特点。在这种情况下，蛋白质和中性多糖保留在溶液中。该复合物可溶于高盐溶液(0.7摩尔/升氯化钠)，核酸可通过有机溶剂提取分离，除去蛋白质、多糖和酚类等杂质，然后加入乙醇沉淀。注意：十六烷基三甲基溴

2、化铵溶液在低于15时会沉淀，因此在加入到冷的植物原料中之前必须预热，离心时温度不应低于15。5，经典配方5，CTAB萃取缓冲液，Tris-HCl (pH8.0)提供缓冲环境，防止核酸被破坏；乙二胺四乙酸螯合Mg2或Mn2离子并抑制脱氧核糖核酸酶活性。氯化钠为DNP(脱氧核糖核蛋白)提供了高盐环境。CTAB溶解细胞膜并结合核酸，这使得核酸易于分离。-巯基乙醇是一种抗氧化剂，能有效防止苯酚氧化成醌，避免褐变，并使苯酚易于去除。基因组DNA CTAB法。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)萃取缓冲液的改进配方，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是一种酚的络合物，它能与多酚类物质形成不溶性络合物，有效地去除多酚类物

3、质，减少酚对DNA的污染；同时，它可以与多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA CTAB法。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，PVP按其平均分子量分为四个等级，通常用K值表示，不同的K值代表相应的聚乙烯吡咯烷酮的平均分子量范围。K值实际上是与聚乙烯吡咯烷酮水溶液相对粘度相关的特征值，粘度是与聚合物分子量相关的物理量，因此K值可以用来表征聚乙烯吡咯烷酮的平均分子量。通常，k值越高，粘度越高，附着力越强。在研磨过程中，加入聚乙烯吡咯烷酮，其中的一氧化碳氮基团有很强的能力结合多酚，这减少了从源头氧化酚类的机会。同时，在提取物中加入还原剂巯基乙醇，可以破坏多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易氧化，然后通过提取去除。

4、8，CTAB法流程图，植物材料，裂解物，上清液溶液，液氮研磨，提取，细胞裂解，干燥和溶解，离心洗涤，醇沉，DNA溶液，基因组DNA CTAB法，9，SDS法原理，基因组DNASDS法，SDS是一种阴离子洗涤剂增加盐的浓度(KAc或NH4Ac)和降低温度(冰浴)以沉淀蛋白质和多糖杂质，并在离心后除去沉淀物；用苯酚/氯仿提取上清液中的脱氧核糖核酸，重复提取后用乙醇沉淀水相中的脱氧核糖核酸。十二烷基硫酸钠脱氧核糖核酸提取缓冲液，10，2.65水浴60分钟，其间缓慢摇动几次。3.加入150微升5毫升/升LKac，混合均匀，冰浴约15分钟。11，SDS法流程图(以动物组织为例)，SDS法基因组DNA，1

5、2，其他方法的基因组DNA，物理方法：玻璃珠法，超声波法，研磨法，冻融法化学方法：异硫氰酸胍法，碱裂解法生物方法：根据不同的细胞裂解方法：13，其他方法的基因组DNA，吸附材料结合法：根据不同的核酸分离纯化方法：硅胶材料阴离子交换树脂磁珠，高盐低酸碱度结合核酸，低盐高酸碱度洗脱。快速高效。低盐高酸碱度结合核酸，高盐低酸碱度洗脱。它适用于高纯度要求的实验。磁性粒子上不同的基团可以吸附不同的物体，从而达到分离的目的。基因组DNA的其他方法，浓缩盐法：有机溶剂萃取法：密度梯度离心法：RNP和DNP因其在盐溶液中的溶解度不同而被分离，有机溶剂作为蛋白质变性剂，同时抑制核酸酶的降解，不同的内容物根据不同

6、的内容物密度不同的原理被分离。15、质粒DNA碱裂解法，碱裂解法的原理是，染色体DNA大于质粒DNA分子。当DNA溶液用碱处理时，线性染色体DNA容易变性，共价闭合的质粒DNA回到中性pH时，恢复其自然构象；变性的染色体DNA片段与变性的蛋白质和细胞片段结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子以溶解状态存在于液相中，因此它们可以通过离心分离。16，质粒DNA的碱裂解，碱裂解的流程图，对数期细菌，溶液三的中和，溶液一的完全再悬浮，溶液二的裂解，上清液，提取，离心洗涤，醇沉淀，干溶解，沉淀，质粒DNA溶液，17，SDS碱裂解提取质粒DNA中溶液1的成分和功能，乙二胺四乙酸抑制DNA酶活性。在该步

7、骤中，还可以将核糖核酸酶加入到溶液中，不受乙二胺四乙酸的影响，并且可以在随后的步骤中去除。0.2M氢氧化钠/1%十二烷基硫酸钠溶液主要是碱，而不是十二烷基硫酸钠，所以称之为碱提取。溶液3M醋酸钾/2M醋酸钾代替十二烷基磺酸钠中的钠，得到十二烷基磺酸钾沉淀；SDS容易与蛋白质结合，平均两个氨基酸与一个SDS分子结合。钾离子和钠离子置换产生的大量沉淀将自然沉淀大多数蛋白质，同时，基因组DNA也将被PDS共沉淀。18、质粒DNA沸腾法，沸腾法原理，染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而染色体DNA是线性分子，而质粒DNA是共价闭合的环状分子；当DNA溶液加热时，线性染色体DNA容易变性，而共价闭环质

8、粒DNA在冷却时恢复其自然构象；变性的染色体DNA片段与变性的蛋白质和细胞片段结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子以溶解状态存在于液相中，因此它们可以通过离心分离。19，细胞器DNA的差速离心，差速离心的原理，是一种利用物质的不同比重来分离混合物的方法。将待分离的物质置于均匀介质(蔗糖)中，以一定速度离心，比重较高的物质优先沉降，而比重较低的物质在上层，从而被分离。线粒体和叶绿体是生物体中的半自主细胞器，它们可以自己编码蛋白质。它们的比重和大小是恒定的，因此在相同的离心场中沉降速度也是恒定的。根据这一原理，细胞中的各种成分以不同的速度离心分离。20，脱氧核糖核酸提取的基本步骤，一，材料制

9、备二。细胞破裂或胶囊内容物释放。核酸分离和纯化。核酸的沉淀或吸附以及杂质的去除v .溶于适量缓冲液或水中的核酸。材料制备，优选使用新鲜材料，低温保存的样品材料不应反复冷冻和解冻以提取血液基因组DNA。选择有核细胞(白细胞)进行组织培养时，细胞培养时间不宜过长，否则会导致DNA降解。含病毒的液体物质DNA含量较少，因此在提取前应进行富集，提取基因组DNA、提取质粒DNA，在对数生长期使用新鲜细菌时应增加筛选压力(老化细菌导致开环质粒增加)，否则细菌容易污染，质粒容易丢失。尝试选择高拷贝质粒。如果是低拷贝或大质粒，应增加细菌数量，不应频繁转移菌株(质粒丢失)。22、严格质粒和松散质粒。根据复制特性

10、，质粒可分为两类：一类是严格质粒，当一个细胞的染色体复制一次时，质粒复制一次，只有12个质粒一般来说，大分子量质粒属于严格型。分子量较小的质粒属于松弛型。质粒的复制有时与其宿主细胞有关。一些质粒在大肠杆菌中复制紧密，而在变形杆菌中复制松散。细胞裂解时，材料应适当，过多会影响裂解，导致脱氧核糖核酸少，纯度低。根据不同的材料，选择合适的裂解预处理方法：植物材料研磨动物组织匀浆或研磨组织培养细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母酶或玻璃珠高温浴，定期轻轻摇动，提取基因组DNA，提取质粒DNA，将适量细菌的培养基完全去除，细菌在悬浮液中充分悬浮和变性的时间不要太长(5分钟)，否则质粒容易被打断，复性时间也不要

11、太长，否则会有基因组DNA的污染。G菌和酵母质粒的提取应采用酶或机械方法进行破壁处理。24、核酸分离和纯化，当用吸附材料分离脱氧核糖核酸时，应提供相应的缓冲体系。当使用有机(苯酚/氯仿)萃取时，应充分混合。然而，当两相通过温和的离心分离时，应确保一定的速度和时间(猕猴桃提取，10，000转20分钟)。根据不同材料的特点，提取过程辅以相应的杂质去除方法、基因组DNA提取、质粒DNA提取、25、核酸分离纯化。蛋白质去除：苯酚/氯仿萃取物用变性剂(SDS、异硫氰酸胍等)处理。)和高盐洗涤蛋白酶。26。脱多糖：高盐法：用乙醇沉淀时，向待沉淀溶液中加入1/2体积的5M氯化钠，高盐能溶解多糖。多糖水解酶降

12、解多糖。在提取缓冲液中加入一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基反应，从而去除多糖。用聚乙二醇8000代替乙醇沉淀脱氧核糖核酸：在500升脱氧核糖核酸溶液中加入200升20%聚乙二醇8000(含1.2 M氯化钠)，冰浴20min。核酸的分离和纯化，多酚的去除：添加试剂以防止酚类的氧化：巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等。添加容易与酚类结合的试剂，如聚乙二醇和聚乙二醇，它们与酚类有很强的亲和力，可以防止酚类与脱氧核糖核酸结合。核酸的分离和纯化，盐离子的去除：70核酸的沉淀和溶解，当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇进行沉淀，当沉淀更充分时加入1/10体积的NaAc(pH5.2

13、，3M)，这有利于充分沉淀，然后用70%的乙醇洗涤除去盐离子和干燥的DNA。让乙醇完全挥发(不要过度干燥)。如果储存时间较长，建议用TE缓冲液将乙二胺四乙酸溶解在TE中，以螯合Mg2或Mn2离子，并抑制DNase的酸碱度至8.0，这样可以防止DNA的酸解、基因组DNA的提取、质粒DNA的提取、29、DNA中含有蛋白质、多糖、多酚等杂质，并且在溶解之前，还有酒精残留。酒精抑制随后的酶水解反应的脱氧核糖核酸中残留的金属离子，重新纯化脱氧核糖核酸，去除蛋白质、多糖、多酚等杂质。(见前面的方法)，重新沉淀脱氧核糖核酸，并充分挥发乙醇，以增加70乙醇的洗涤次数(2-3次)。脱氧核糖核酸提取中的常见问题，

14、问题1:不纯的脱氧核糖核酸样品抑制随后的酶水解和聚合酶链反应。原因，对策，30，材料不新鲜或反复冻融不能很好地抑制内源核酸酶的活性。提取过程过于激烈，脱氧核糖核酸被机械中断，并被外源核酸酶污染。试着用新鲜的材料。低温保存材料，避免反复冻融。在液氮中研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。从富含内源核酸酶的物质中提取脱氧核糖核酸时，可以增加裂解液中螯合剂的含量。细胞裂解后的后续操作应尽可能温和。所有试剂应使用无菌水制备。消耗品应在高温下灭菌，并储存脱氧核糖核酸，对策，原因，31，实验材料较差或较少破碎或开裂，沉淀时DNA丢失，洗涤不完全，尽量选择新鲜(幼)的材料，动植物应匀浆并充分研磨；G菌和酵母在裂解前用生物酶或机械手段破碎时，时间应适当延长(对于动物细胞和细菌，可增加PK的量)。当沉淀时间延长，加入辅料促进沉淀洗涤时，最好用枪头吸出洗涤液，但不要倾倒。在脱氧核糖核酸提取中有一个共同的问题。问题3:提取的脱氧核糖核酸量很少。策略，原因。32，猕猴桃DNA提取实例，1。十六烷