第6章-基因工程的酶学基础.ppt

1、第六章 基因工程的酶学基础,限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶和反转录酶 DNA修饰酶 外切核酸酶 单链内切核酸酶 RNA酶,核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而使核酸分子断链。 根据水解的不同方式，分为： 外切核酸酶（exonuclease） 内切核酸酶（endonuclease） 根据作用的核酸底物不同，分为： RNA酶 DNA酶 底物非专一性核酸酶,6.1 限制性内切酶,定义：限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,1.细菌限制修饰系统的发现 20世纪6

2、0年代在研究噬菌体的寄主范围时发现的。 从天然宿主大肠杆菌K中分离得到的k噬菌体，当其感染B菌株时，感染率仅为10-4，分离得到幸存的子代k病毒，再用其感染B菌株，感染率为100%；若再用其感染K菌株，感染率又降为10-4。此现象称为宿主限制现象。,一、限制性内切酶的发现,各种细菌都能合成一种或几种能够切割双链DNA的内切核酸酶，以此来限制外源DNA在自身细胞内的存在。 几乎所有的限制性内切酶都和能识别甲基化相同DNA位点的甲基转移酶共同作用，构成限制-修饰系统。 宿主细胞的DNA被甲基转移酶修饰而被保护起来，不被限制性内切酶识别，从而使自身DNA免受降解。,2. 限制酶HindIII的发现

3、Smith 等于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindIII限制酶。 3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 Nathans（1971年）用HindIII绘制SV40的限制酶谱。,二、限制性内切核酸酶的类型,已经鉴定出的限制性内切核酸酶可分为4种不同类型： 型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别位点附近的核苷酸切割DNA双链，但切割序列是随即的，无专一性。在基因工程中应用不大。 型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别序列的固定位置切割双链DNA分子，是基因工程中最常用的工具酶。,型酶：有专一的识别序列，但不是对称的回文序列，在识别序列旁边的位置上切割

4、双链。切割后产生的DNA片段具有各种单链末端。 型酶：新鉴定出的一种酶，目前无应用。,命名原则： 属种株分离序号 例如：EcoR 属：Escherichia 种：coli 株：R 分离序号：,三、限制性内切酶的命名,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hind,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,（一）识别序列的特异性 大多数型限制内切酶的识别序列长度为46bp，具有双重旋转对称结构的回文序列（palindromic sequence）。,四、

5、型限制内切酶的基本特性,BamH：,如果识别序列由5对碱基组成，其对称轴为中间的一对碱基，如Mae的识别序列为：,-GTNAC- -CANTC-,其中，N为任意碱基。,回文诗,悠悠绿水傍林偎， 日落观山四望回。 幽林古寺孤明月， 冷井寒泉碧映台。 鸥飞满浦渔舟泛， 鹤伴闲亭仙客来。 游径踏花烟上走， 流溪远棹一篷开。,开篷一棹远溪流， 走上烟花踏径游。 来客仙亭闲伴鹤， 泛舟渔浦满飞鸥。 台映碧泉寒井冷， 月明孤寺古林幽。 回望四山观落日， 偎林傍水绿悠悠。,有些限制性内切酶的识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专一，但不影响其作用位点，只是增加酶的识别和作用频率。如Hind识别序列为-GTY

6、RAC-，其中Y表示C或T，R表示A或G。 有的酶识别6个以上的核苷酸序列，称为稀有限制性内切酶，如Not，识别序列为（GCGGCCGC）,（二）切割位点的特异性 1.DNA分子酶切片段的末端 切割：水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为磷酸基，3 端为羟基。,酶切后产生的片段末端有黏性末端和平末端等形式。 黏性末端：DNA分子在限制性内切酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构。它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。,（1）在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。靠近5 端切割产生 5 端突出的粘性末端，如EcoRI ：,（2）靠近 3 端切割产生3 端突出的粘性

7、末端。如Pst I：,（3）在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（blunt end），如SmaI：,2.同切点酶（或同裂酶，isoschizomer） 同裂酶：是一类来源于不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。,例：Sma CCC GGG Xma C CCGGG,识别序列相同，切割位点不同,识别序列相同，切割位点也相同,例：Hpa与Msp识别顺序都是CCGG,3.同尾酶（isocaudamer） 定义：来源不同，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端。,Bam H,Bg l,+,+,1.酶的纯度 2.DNA样品的纯度 高纯度DNA是必需的 样品如果残留氯

8、仿、苯酚、乙醇、EDTA、SDS等物质，或蛋白质、多糖等都可能影响内切酶的反应活性。 如果DNA纯度不高时，可采取以下措施： 增加酶的用量、扩大反应体系体积、延长反应时间、添加阳离子亚精胺等。,五、影响限制内切酶活性的因素,3.DNA的甲基化程度 识别序列中特定核苷酸的甲基化会影响酶的活性。 在基因克隆中是使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。 可根据各种同裂酶所具有的不同的甲基化敏感性研究真核基因组DNA的甲基化作用模式。例如，MspI可以切割甲基化的CCGG，而HpaII不能切割甲基化的序列。,4.酶切反应的温度 大多数限制性内切酶的最适反应温度为37。,表2-3 部分限制性内切

9、酶的最适反应温度,5.DNA分子的构型 某些限制酶，切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍。 还有些限制性核酸内切酶切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显的差别。 大多数内切酶对只含识别序列的寡聚核苷酸不具有催化活性。,2hr 20hr HindIII CAAGCTTG 0 0 CCAAGCTTGG 0 0 CCCAAGCTTGGG 10% 75% EcoRI GGAATTCC 90 90,6.反应缓冲液 pH范围： 7.07.6 缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷）、NaCl、 MgCl2、二硫苏糖醇（DTT）或-巯基乙醇 有些酶需

10、要BSA，以防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。,7.酶的星号活性（star activity） 当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，称为星号活性。 EcoR正常情况下，其靶子序列为GAATTC，但若缓冲液pH8、盐离子浓度低于50mm和甘油超过5%（V/V），可在NAATTN处切割，以EcoRI*表示,8.限制性内切酶反应的终止 消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性。 钝化大多数限制性内切酶的方法是65温浴5分钟。 但有些酶，如BamH I和Hae具备对热稳定性，则需加入终止反应液（加入0.5molL的EDTA使之在溶液中的终浓度达到

11、10mmol/L 以螯合Mg2+）。,1.DNA分子的双酶切消化 可以先后分别在不同的反应体系中进行： 先用需要低盐离子浓度的酶切割，再调节盐离子浓度，加入另一种酶切割。 先用最适反应温度较低的酶切割，升温后再加入第二种酶。,六、限制内切酶对DNA的消化,2.DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化 完全酶切消化：内切酶对DNA序列中全部的识别序列进行切割。 部位酶切：内切酶对DNA序列中所有的识别序列进行不完全切割。,酶切反应注意事项 价格昂贵 决不能用水稀释,以免变性失活。 预先加入除酶以外的所有其他试剂。 取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。 使用无菌的新吸头。 少加水,使体积最小,但

12、保证酶液体积不超过总体积的10,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。,6.2 DNA连接酶,一、DNA连接酶的发现 DNA连接酶（DNA ligase）是能催化双链DNA片段靠在一起的3羟基末端与5端磷酸基因末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接在一起。“分子黏合剂”,依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类： 依赖ATP的DNA连接酶 依赖NAD+的DNA连接酶 依据其来源可分为三类： T4噬菌体DNA连接酶、 大肠杆菌DNA连接酶 热稳定DNA连接酶。,二、DNA连接酶的特点 连接反应需要一条DNA链游离的3-OH，另一条链5末端具有磷酸基团。 连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+为辅因子和激活

13、因子。 DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子！ DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA骨架上的缺口（nick），不能封闭失去核苷酸所形成的裂口（gap）,三、DNA连接酶的作用机理,四、影响连接反应的因素,1.反应温度： 黏性末端：415比较合适 平末端：1020 2.连接酶浓度： 平末端连接所需酶量较多 黏性末端连接所需酶量较少。,3.ATP浓度 一般情况下ATP最适的终浓度为0.5mmol/L。 当ATP浓度上升至5.0mmol/L时，将影响酶对平末端的连接； 当ATP浓度上升至7.5mmol/L时，对黏性末端及平末端的连接均有抑制作用。,4.DNA片段末端,6.3 DNA聚合酶和反转录

14、酶,DNA聚合酶（DNA polymerase）：在引物和模板的存在下，把dNTP连续加到DNA分子3-OH末端，催化核苷酸的聚合。 分为两类： 依赖于DNA的DNA聚合酶 依赖于RNA的DNA聚合酶-反转录酶,一、DNA聚合酶,. E.coli DNA聚合酶I（polI）-Kornberg酶,1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK) 2） 聚合酶活性，53, 要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响 3） 外切酶活性：具35和53外切酶活

15、性,5-3聚合酶活性,条件 : Mg2+ dNTP 3-OH,沿3 5方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。 在体内DNA复制时起校对作用，保证了DNA复制的真实性，从而降低突变率。,3- 5外切酶活性,可降解DNA：RNA杂合体中的RNA分子 带切除的核酸分子必须具有5端游离的磷酸基团； 核酸分子被切除前位于已配对的DNA双螺旋区段上； 被切除的可以是脱氧核苷酸，也可以是非脱氧核苷酸,5 - 3外切酶活性,DNA聚合酶的重要用途是用于缺口平移法制备核酸的杂交探针。,. Klenow片段 Klenow片段具有DNA聚合酶的聚合酶活性和3-5外切酶活性 补平 3 凹端 DNA 。使用单

16、纯的 DNA 合成活性。注意要加足够的 dNTP ；如果使用带标记的 dNTP ，则可对 DNA 进行末端标记。, 抹平 DNA 3 凸端。在 35 外切活性作用下，可切除突出的 3 凸端。注意必须加足量 dNTP ，否则外切活性不会停止。,用于Sanger双脱氧末端终止法进行DNA序列分析 在 cDNA 克隆中合成第二链 在单链模板上延伸寡核苷酸,. T4 DNA聚合酶,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性 在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位,T4-DNA聚合酶的基本用途： DNA片段

17、的同位素末端标记,T4-DNA pol,T4-DNA pol,Mg2+ 5 ppp dNTP a-32P-dATP,T4-DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3粘性末端,.T7噬菌体DNA聚合酶 53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性 已知DNA聚合酶中持续合成能力最强 改造后成为双脱氧终止法对长片段DNA的测序酶,T7噬菌体DNA聚合酶的基本用途： 用于拷贝长段模板的引物延伸反应 通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记,.耐热DNA聚合酶（Taq酶） Taq酶的特点： 热稳定性 离子依赖性 5-3聚合酶活性和5-3外切酶活性。 在聚合链末端不依赖模板多

18、聚合出一个腺苷（A）,是一种依赖RNA的DNA聚合酶。 商品反转录酶有两种 来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。 来自能表达Moloney鼠白血病毒(M-MLV 反转录酶的基因已克隆到E.coli中表达,二、反转录酶,(1) 5-3 聚合酶活性, 能以RNA或DNA模板合成DNA分子； (2) RNA酶H活性，对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解，免除了在反转录完成后再用NaOH降解RNA模板的步骤。 主要用途：将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。,3AAAAAAAAAAAA,5mRNA,5TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18,反转录酶,Mg2+ dNTP,反转

19、录酶,3 RNA,5 DNA,3 RNA,5 DNA,3,5,反转录酶,5 DNA,3,反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,5,3,6.4 DNA 修饰酶,（一）末端脱氧核苷酸转移酶（TdT） 简称末端转移酶 来源：小牛胸腺 特点： 末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。 在没有模板链的情况下，可以非特异性的将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3-OH。 可以同聚物加尾,如果以dATP或dGTP为同聚物加尾反应的底物则以Mg2+为首选； 如果以dTTP或dCTP为同聚物加尾，则必需有Co2+存在。,TdT,Mg2+ dATP,5 p,3 AAAAAA,

20、AAAAAA 3,p 5,主要用途： 用于克隆DNA片段：平末端DNA片段的末端加尾连接法 用于DNA片段3末端标记,平末端DNA片段的末端加尾连接法,3,3,5,5,3,3,5,5,DNA聚合酶和 T4DNA连接酶,（二）T4多核苷酸激酶 基本特性：催化ATP的-磷酸基转移到在DNA或RNA的5-OH末端，使5末端重新磷酸化。 用于标记DNA或RNA的5末端,T4噬菌体多核苷酸激酶 ATP,单链或双链DNA或RNA,A、正向反应：足够的酶和ATP存在，平末端、5凹陷末端和双链DNA的切（烈）口都能磷酸化,单链或双链DNA或RNA,T4噬菌体多核苷酸激酶 ATP 过量ADP,B、交换反应：过量

21、ADP存在时，DNA分子的5磷酸转移给ADP，然后从ATP那里获得-32P基团,能催化核酸分子脱掉5的磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5-P末端转换成5-OH末端。 来源： 从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶(Bacterial Alkaline Phosphatase)简称BAP ，具耐热性； 从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)，简称CIP，70可灭活，使用更广泛。,（三）碱性磷酸酶,其主要用途有： 在用32P标记DNA 5端之前，去除5端的磷； 在DNA重组技术中，去除DNA片段的5磷酸，防止载体的自身环化，

22、提高重组子比例。,外切核酸酶：从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。 分类： 作用于单链的外切核酸酶 作用于双链的外切核酸酶,6.5 外切核酸酶,一、大肠杆菌外切核酸酶VII（exoVII） 反应不受二价阳离子影响 ，不需要Mg2+ 从单链DNA的两端同时消化DNA,二、大肠杆菌外切核酸酶（exo ） 催化双链DNA从3-OH末端开始水解 可以作用平末端、3凹陷末端或有缺口的DNA 不能水解单链DNA和3末端突出的双链DNA,应用： 与Klenow配合使用，制备放射性探针或3标记,A 产生平末端或 or 3 凹端 B 产生 3突出端,A digestion B digestion,A,ex

23、oIII,B,B,B,B,B,B,S1 nuclease Klenow fragment,重新连接,Transformation E.coli,Target sequence,Universal primer,A B,exoIII可以构建单向缺失,Activity!,6.6 单链内切核酸酶,一、S1核酸酶 S1核酸酶来源于米曲霉，它可以降解单链DNA和RNA，产生5磷酸化单核苷酸或寡聚核苷酸。 Zn2+必需 最适pH范围为4.0 - 4.3 需要NaCl 0.1 0.4mol/L 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍,活性：可以降解单链DNA或RNA或双链的单链区。,ssDNA或RNA,5,3,SI酶、 Zn2+、pH4.5,5dNMPs或5rNMPs,SI酶、 Zn2+、pH4.5,+,带缺口的DNA或RNA,SI酶、 Zn2+、pH4.5,黏性末端,平末端,S1核酸酶的重要用途： 去除DNA片段的单链突端，使之成为平端 去除cDNA合成时形成的发夹结构 成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合此酶水解，可定位内含子 S1核酸作图法可测定杂交核酸分子的杂交程度,二、Bal31核酸酶 来源：从埃氏互生单胞菌BAL31中分离 活性： 对单链DNA具有内切酶活性 对双链DNA具有3 5和5 3的外切活性 对两端的水解速度不一定相等 产生5