动物肠道屏障功能对肠道菌群变化的调控

1、动物肠道屏障功能对肠道菌群变化的调控 摘要：动物肠道屏障系统是机体同外界环境接触并且相互作用的最大区域，也是病原体入侵的主要门户。因此，完整和高效的动物肠道屏障系统对调控肠道病原微生物的侵入至关重要。通过介绍肠道屏障系统的构成，综述了不同肠道屏障系统对肠道菌群变化的调控作用。 关键词：动物；肠道屏障；肠道菌群；肠道黏液层；肠道上皮层；肠道免疫层 中图分类号：Q48 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）12-0005-04 DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2018.12.001 Abstract： The animals intestina

2、l barrier system is the largest area where the organism contacts and interacts with the external environment， and is also the largest portal for pathogen invasion. Therefore， a complete and efficient animal intestinal barrier system is essential for regulating the invasion of intestinal pathogenic m

3、icroorganisms. By introducing the composition of the intestinal barrier system， the regulatory effects of different intestinal barrier systems on the changes of intestinal flora were reviewed. Key words： animals； intestinal barrier； intestinal flora； intestinal mucus layer； intestinal epithelium； in

4、testinal immune layer 肠道是动物体内代谢活跃且具有独特免疫功能的器官，同时又是体内最大的细菌库，在机体消化、吸收、代谢和免疫等机能活动中具有重要的作用。研究表明，当肠道菌群发生紊乱后，屏障功能出现损伤，大量细菌和毒素经由门静脉和淋巴系统进入体循环内，这将出现细菌易位及内毒素血症，进一步引发全身炎症反应综合征和氧化应激，最终触发多器官功能衰竭，所以人们广泛认为肠道是导致全身性炎症反应和氧化应激的始动器官。肠道屏障作为将肠腔与机体内环境分隔开来具有完善的功能隔离带，人们通常将其分为机械、生物、免疫及化学屏障。但为了便于理解肠道菌群紊乱与肠道损伤的作用机制，本文将肠道屏障分为肠

5、道菌膜层、肠道黏液层、肠道上皮层和肠道黏膜免疫层。 1 肠道菌膜层 动物胃肠道中包含约10131014个微生物，并由此肠道微生物与宿主肠道上皮之间保持着动态平衡，共同维持着肠道内环境的稳定1。肠道内菌群分布呈明显的纵轴性，细菌与肠黏膜或结合、或黏附、或嵌合，组成有一定规律的膜菌群，形成菌膜屏障结构，通过竞争性限制病原体肠黏膜位点定植、竞争性抑制病原体营养物质摄入产生代谢物直接抑制病原体、激活肠道黏膜免疫反应等多种方式，抑制肠道内病原微生物的过度生长，限制其黏附于肠黏膜2（图1）。肠道黏膜上皮由不同的肠上皮细胞亚群（Intestinal epithelial cells，IECs） 组成，包括M

6、细胞（M cells）、杯状细胞（Goblet cells）、潘氏细胞（Paneth cells）、肠内分泌细胞（Enteroendocrine cells）和柱状肠上皮细胞（Enterocytes）。肠道上皮将机体同外部环境分离，避免遭遇有害抗原如致病性细菌、病毒和致病性共生菌的侵入3。?c道共生菌群对于机体温和或者生理可接受水平的信号刺激以及肠道黏膜免疫体系的发育和维持具有重要的作用，其同肠道黏膜屏障共同构成体内防御肠道有害物入侵的第一道防线4。然而，肠道菌群之间的动态平衡易被打破，应激刺激可通过神经内分泌反应作用于肠道微生物，破坏肠道微生态系统。肠道微生物和上皮细胞或免疫细胞之间动态平衡

7、被破坏和扰乱后，将导致肠道菌群比例、数量、种类、位置发生改变，引起肠道菌群紊乱，造成致病菌过度生长2，5，肠道共生菌的紊乱和致病菌的过度生长会使肠道细菌毒素物质迅速增加，引起肠道炎症反应等病变。 2 肠道黏液层 肠道上皮细胞被一层厚且密实的黏液凝胶所完全覆盖，这层黏液凝胶被称为黏液层。黏液层由多种生物活性分子构成，包括黏蛋白、糖蛋白、三叶因子、抗菌肽和分泌型IgA（sIgA）等。肠道黏液层大体由内层（inner layer）和外层（outer layer）构成，黏液内层和外层厚度不一，受不同肠段和肠道菌落构成的影响，内层厚度大约50 m，外层厚度大约100 m。黏液层内层和外层蛋白组成基本相同

8、，但是在黏液内层黏蛋白2（Muc2）浓度要远大于黏液外层，高浓度的Muc2为黏液内层提供了牢固黏附在上皮细胞层的能力，并限制了共生菌在黏膜内层的定植，抑制肠道菌群与肠上皮的接触。共生细菌通常定植在黏液外层，这表明肠道黏液内层具有强效的抵御病原体的能力6。当肠道菌群紊乱时，病原体会激活肠道黏液降解酶如糖苷酶的活性，糖苷酶则将肠道黏液降解为单糖，破坏黏液层的结构，出现病原体接触宿主肠上皮、激活肠道黏膜的免疫反应7。 3 肠道上皮层 肠道上皮层是体内最大的黏膜表层，其表面积大于300 m2，由不同的IECs组成，包括肠道多能干细胞、M细胞、杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞和柱状上皮细胞8（图2）。肠

9、道上皮是成熟哺乳动物自我更新频率最高的组织，平均3-4 d肠上皮细胞将更新一次。不同IECs协同作用构成机体生理屏障，分泌消化酶，参与营养物质吸收和代谢，感应抗原刺激，分泌抗菌蛋白，激活肠道黏膜免疫应答反应，维持肠道内环境稳态，保证肠道消化、吸收、代谢和免疫等机能正常活动9。 3.1 肠道干细胞 肠道干细胞（Pluripotent intestinal epithelial stem cells，pluripotent ISECs）主要起到更新肠上皮的作用。肠上皮细胞除潘氏细胞外，可不断由隐窝底部向肠绒毛移行、分化并逐渐衰老、脱落，进行更新和修复，隐窝内的不同位置细胞处于不同的分化时期。隐窝底

10、部的多能性肠上皮细胞干细胞不断增殖和分化，形成不同的肠道上皮细胞10。 3.2 肠道杯状细胞 杯状细胞是肠道主要的内分泌细胞，其在肠上皮细胞中的数量由十二指肠（约4%）到结肠末端（约16%）逐渐增加10。杯状细胞分泌的黏蛋白、三叶肽（TFF3），Fc-结合蛋白、抵抗素样分子（RELM）在肠道黏液层的形成中具有重要作用。黏蛋白是构成黏液层的主要成分，蛋白分子TFF3可以促进黏蛋白之间相互作用，构成网状结构，促进上皮细胞修复并抑制其凋亡。而RELM通过促进杯状细胞分泌黏蛋白，调节巨噬细胞在炎症中的反应7。所以杯状细胞通过影响黏液层的构成，在肠道菌群的定植和维持肠道微环境的稳定中扮演了重要的作用。

11、3.3 内分泌细胞 内分泌细胞和杯状细胞一样，也是体内的分泌细胞，约占肠上皮细胞总数的1%。肠道内分泌细胞可分泌不同的激素和神经递质作用于肠道，对维持肠道结构和功能完整具有重要的作用11。虽然肠道内分泌细胞和肠道菌群结构之间互作关系尚未完全阐明，但研究报道指出，当机体遭到应激时，大脑会整合应激刺激，通过交感和副交感神经作用于肠道上皮内的分泌细胞，使去甲肾上腺素大量分泌，通过影响黏液分泌改变肠道蠕动，并且通过促进病原体的生长和定植等方式，改变肠道菌落环境，影响肠道稳态12，13。 3.4 柱状肠上皮细胞 柱状肠上皮细胞呈高柱状，是小肠黏膜上皮中最主要的细胞，数量最多。相邻柱状细胞之间通过紧密连接

12、蛋白、黏附连接蛋白和桥粒形成紧密连接结构，能防止肠腔内细菌、毒素和炎症介质等抗原经细胞间隙穿过上皮细胞层进入周围组织。柱状肠上皮细胞具有一定的内分泌作用，能够产生碱性磷酸酶对肠道病原体主要代谢物LPS起到脱毒作用。柱状肠上皮细胞质膜基底部具有免疫球蛋白结合受体，通过胞转作用，将黏膜层底部的IgA转化为sIgA，用于缓解病原体毒性。另外，柱状肠上皮细胞分泌的糖蛋白可在其游离面的微绒毛表面形成一层较厚的细胞衣，并且细胞衣的糖蛋白与细胞膜的蛋白质和脂质牢固结合，对肠上皮细胞能产生保护作用，是肠道机械屏障的主要结构。 3.5 M细胞 M细胞主要位于肠道滤泡上皮（Follicle-associated

13、epithelium，FAE），覆盖着肠道次级淋巴结构。M细胞具有特殊的形态结构，与肠细胞不同，M细胞的质膜顶端具有短小、不规则的微绒毛，便于肠道微生物与M细胞的顶端接触和胞转。M细胞刷状缘消化酶的活性很低，因此消化和吸收不是M细胞的主要功能。此外，在M细胞质膜的顶端具有识别和结合细菌鞭毛蛋白FimH的糖蛋白GP2，而在M细胞质膜的基端，具有包含B细胞、T细胞等淋巴细胞和树突状细胞（Dendritic cells，DCs）、巨噬细胞等抗原呈递细胞的口袋状微皱结构，这种特殊的结构使病原体易于和M细胞结合，并胞转进入固有层的病原体与免疫细胞树突状细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞上的PRR受体相作用，从而

14、启动体内免疫反应，以维持肠道和菌落稳态。研究报道指出，多种病原微生物能够通过M细胞侵入宿主固有层，因此M细胞又被称为肠道屏障的“阿喀琉斯之踵”14。 3.6 潘氏细胞 潘氏细胞是位于肠隐窝底部的浆液性腺上皮细胞，其主要特征是细胞内含有大量内质网和高尔基体，用于产生细胞质颗粒如溶菌酶、A 型分泌性磷脂酶A2（GroupA secreted phospholipase，AsPLA2）、防御素（Defensin）、血管生成素4（Angiogenin 4，Ang4）、C-型凝集素（Reg）等多种抗菌肽，以杀灭病原体，抑制菌群在肠道上皮的定植，维持肠道稳态15。潘氏细胞上的Toll样受体（Toll-li

15、ke receptors，TLRs）能识别肠道内致病性和非致病性病原体的结构组成部分，如脂多糖和磷脂壁酸等，诱导潘氏细胞表达和分泌抗菌蛋白16；并且有助于肠黏膜的先天性免疫，主要是通过感知肠道有害细菌后释放出具有杀菌活性的物质，其主要是-防御素。潘氏细胞分泌的防御素可在肠隐窝局部维持较高的浓度，从而保护邻近的细胞免受肠道病原体的侵袭，同时，可以有选择地杀灭肠道内的共生菌，从而维持肠道内的正常菌群组成和动态平衡性17。 4 肠道黏膜免疫层 肠道黏膜免疫系统由肠道弥漫分布的淋巴细胞和肠黏膜相关性淋巴组织（Gut-associated lymphoid tissue，GALT）构成。前者包括肠上皮间

16、淋巴细胞和固有层等处的淋巴细胞，后者由派氏?Y、肠系膜淋巴结和盲肠等部位的淋巴组织构成。肠上皮间淋巴细胞、派氏结、固有层淋巴细胞直接参与了对肠道中抗原的处理和免疫反应，它们在保障黏膜完成正常生理功能的同时避免病原体的入侵、维持肠道内稳态。由于它们所处的环境与肠黏膜密切相关，因此也统称为肠道黏膜免疫系统（Intestinal mucosal immune system，IMIS）18。按功能可将肠道黏膜免疫系统分为两个部分，一个是免疫应答的“诱导部位”（Inductive sites），由一些肠道的淋巴组织和散在的淋巴细胞组成；另一个是免疫应答的“效应”部位（Effector sites），如肠

17、道黏膜固有层中的淋巴细胞。抗原到达肠腔后，在诱导部位被抗原提呈细胞捕获、加工处理并提呈给免疫活性细胞，诱发免疫应答19。免疫反应产生的一个限制性步骤就是抗原识别、处理与呈递，参与肠道黏膜抗原提呈的细胞及分子数量多、种类多，相互作用复杂，并且有其特有的性质。 4.1 黏膜监视 肠道黏膜免疫系统在对无害抗原的免疫耐受和对有害抗原的免疫应答中必须处于微妙的动态平衡，才能维持机体健康，准确识别有害、无害抗原以及对有害抗原产生迅速有效的免疫反应，这对机体来说至关重要。肠道上皮细胞对肠道微生物结构和组成的迅速感应对于维持肠道结构和功能的完整性具有重要作用，是启动固有免疫的关键。Xavier等19首次提出黏

18、膜监视器（Mucosal monitors）这一概念，因为肠道上皮中有大量的敏感细胞群如M细胞和潘氏细胞，其作为肠道黏膜“监视者”，通过模式识别受体（Pattern-recognition receptor，PRR）识别微生物结构成分-病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMP），从而迅速感觉肠道菌群的变化，一方面通过促进M细胞和潘氏细胞分泌抗菌肽的方式清除病原体，另一方面可通过信号传导至黏膜免疫细胞，经过黏膜免疫细胞（DCs、单核吞噬细胞、B淋巴细胞）的激活和静息，对肠道菌落做出适度的响应，以维持肠道内环境稳态。目前研究较多的PR

19、R有Toll?邮芴寮易濉塑账峤岷瞎丫刍?结构域（Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）蛋白家族、RIG-I样受体（RIG-I-like receptor，RLR）家族，相应的PAMP有脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、胞壁酰二肽（Muramyl dipeptide，MDP）、脂质A、脂磷壁酸、脂蛋白、脂肽和含非甲基化CpG基序的寡聚核苷酸（CpG-ODN）等20。 4.2 肠道树突状细胞和肠道巨噬细胞 肠道菌群持续紊乱时，天然免疫（Innate immunity）和获得性免疫（Adpative immunity）之间的

20、相互作用在清除病原体的过程中发挥着重要的作用。机体感染病原体后，天然免疫细胞首先发挥作用，当天然免疫不能够彻底清除病原体时，获得性免疫随之产生。巨噬细胞和树突状细胞这两种关键的免疫细胞对于天然免疫向获得性免疫的转化至关重要。黏膜组织的淋巴样器官（Peyers patches，PP结）和固有层（Lamina propria，LP）内存在大量的树突状细胞和巨噬细胞，巨噬细胞和树突状细胞是两种重要的免疫细胞，在天然免疫和获得性免疫过程中具有不可或缺的作用。在天然免疫中，巨噬细胞主要通过吞噬作用杀伤和清除病原体及异物，并释放多种炎性因子介导炎症反应，在获得性免疫中主要发挥免疫调节及抗原提呈功能。而树突

21、状细胞是最重要的专职抗原提呈细胞（Antigen-presenting cells，APCs），是天然免疫和获得性免疫间的“桥梁细胞”。 长久以来，树突状细胞都被认为是惟一能够显著刺激初始型T细胞增殖的抗原提呈细胞，而巨噬细胞和B细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞。黏膜树突状细胞表达紧密连接蛋白，其水平受细菌或细菌产物调节，树突状细胞通过紧密连接蛋白与附近的上皮细胞在结构上建立紧密的连接，维持肠道上皮屏障结构和功能的完整性。当肠道菌群紊乱时，固有层的树突状细胞能够打开邻近上皮细胞间的紧密连接，延伸树突至肠腔捕获细菌直接穿越黏膜上皮。无数个延伸的突触形成网络结构，感受肠道稳态的变化，将信号传至固

22、有层，并且这种抗原摄取方式受到CX3CL1（上皮细胞产生的一种趋化因子）的调节。在CX3CR1受体基因敲除的小鼠体内，树突状细胞被趋化至肠腔，但不能延伸树突穿越上皮细胞，小鼠对沙门氏菌感染敏感性提高。这种调节的分子机制可能是CX3CR1与它的配体相互作用调节紧密连接蛋白的表达，因为紧密连接蛋白是树突状细胞在上皮细胞间匍匐延伸所必需的分子21。 巨噬细胞通过模式识别受体与抗原异物结合后，再通过胞吞和胞饮作用将其摄入细胞内，经杀菌系统杀伤病原体，后在多种溶解酶作用下降解消化细菌。杀菌系统包括氧依赖和非氧依赖两种，前者包括活性氧中间物和活性氮中间物，通过呼吸爆发作用激活膜上还原性辅酶，活化分子氧，生

23、成的活性氧具有杀菌作用；后者主要通过酸性pH、溶菌酶、防御素等裂解杀伤抗原异物。此外，巨噬细胞表面有MCP-1、IFN-、巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）等细胞因子的受体，感染部位组织细胞产生的MCP-1、IFN-、MCSF等细胞因子与其表面相应受体结合，招募并活化巨噬细胞，增强其吞噬杀菌能力。与此同时，活化后的巨噬细胞通过多种途径参与和促进炎症反应，进一步增加炎症因子的表达量。 5 小结 肠道菌群在维持机体肠道结构和功能的完整中具有重要作用，但是大量微生物的定植同时也给肠道带来炎症和感染的风险。正常生理状态下，肠道黏膜系统与肠道菌群相互作用相互识别，维持精妙的动态平衡，发挥其生物学功能。但机

24、体遭遇应激时，多种因素作用于肠道，导致肠道菌群紊乱。肠道微生物直接作用于肠道上皮表面，肠道监视细胞M细胞和潘氏细胞迅速反应，一方面通过促进抗菌肽的分泌直接抑制病原体，另一方面通过胞吞作用将病原体转运至固有层，激活体内先天免疫反应。此外，肠道树突状细胞能直接打开细胞紧密连接，直接穿透肠上皮细胞，将信号分子传递至固有层，嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞向感染部位聚集，同时作用于T细胞启动获得性免疫。肠道黏膜的免疫应答可以快速地把有机体和毒素吞噬掉，维持肠道内的环境稳定；但机体持续遭受应激时，过度的免疫应答会导致中性粒细胞在吞噬毒素的同时释放出大量的氧自由基和炎症因子，这将引起肠道上皮的损伤，进一

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