第五章 细胞培养.ppt

1、第五章细胞球培养植物细胞培养(plant cell culture )是在离体条件下培养植物的个别细胞球或小的细胞球块使之增殖的技术，根据培养规模进行了：小规模培养和大量培养的培养方式：的悬浮培养、单细胞球培养等根据需要生成物：进行了变异诱导的细胞球培养和二次生产1 .单细胞球分离2 .悬浮培养3 .单细胞球培养技术4 .植物细胞球的大规模培养和次生产物生产1 .单细胞球分离从完整的植物器官分离培养组织中分离单细胞球1 .从完整的植物器官中分离单细胞球叶是分离单细胞的最佳材料机械法酶解法1-1、机械法第一、1-2、酶解法、 Takebe等人(1968 )发现，通过果胶酶处理可分离大量的叶肉细胞

2、，2、可从培养组织中分离出单细胞球、茎，步骤： (1)愈伤组织的诱导产生，(2)愈伤组织反复传代，使组织增殖，提高愈伤组织的稀疏度，摇床用于振动，(3) (Suspension culture )用液体培养基培养愈伤组织，选择建立悬浮培养物、15ml medium/1g、120rpm culture、transfer1tiiii的合适的培养基：高浓度荷尔蒙激素浓度，特别是生长素、水解作用干酪素、Pro、Gln等必要的加成物质。 世代重叠，得到均匀稀疏的愈伤组织。 二、细胞球悬浮培养、一、细胞球悬浮培养的概念和意义悬浮培养是将单个游离细胞球或小细胞球块悬浮在液体培养基中培养增殖的技术。、Shak

3、er for suspension culture，Culture wheel，1、细胞球可不断增殖，形成高密度的细胞球群，适合大规模培养。 2 .可以提供大量比较均匀的细胞球，为研究细胞球的生长、分化创造方法和条件。 细胞球悬浮培养的应用，三.细胞球悬浮培养的方法1，对于用培养基愈伤组织调制的悬浮细胞球培养的培养基，优选用原愈伤组织传代时的培养基除去琼脂。 为了提高细胞球的分散度，需要调节生长素与分裂素的比率。 2、培养细胞球的起始密度和细胞球数(1)最低有效密度的概念悬浮细胞球培养中，悬浮培养细胞球能够增殖的最小接种量称为最低有效密度或临界起始密度。 最低有效密度因培养材料、原种培养条件、

4、原种保存时间长度、培养基成分而异，但一般为104105细胞球/ml，(2)细胞球计数可保证细胞球培养的最低有效密度，计数细胞球游离后分离的单细胞球，使用血细胞计数板。 (3)生细胞球测定除了测定细胞球密度外，以生细胞球率为测定开始密度的参考生细胞球率(%)=(5视野中的生细胞球数/5视野中的细胞球总数) *100%，生细胞球的测定方法a、冰乙酸酯荧光素(FDA )染色法FDA本身没有荧光，无极性，可通过原生质膜进入细胞内部进入后，由于受到活的细胞球内脂肪酶分解，产生荧光的极性物质萤光素，不能自由进入原生质体膜，在落射荧光显微镜下观察荧光有活力，相反没有活力。 具体操作：取0.5ml细胞球混悬剂

5、装入小试管，加入FDA溶液使最后浓度达到0.01%，混合，在室温下作用5min，用落射荧光显微镜观察。b、酚藏红花染色法先配制0.1%酚藏红花溶液，溶剂为培养液。 检查时取一滴漂浮的细胞球放在载玻片上，滴下0.1%酚红花黄，盖上玻璃罩，染成红色的是死亡的细胞球，无色的是活着的细胞球。3、悬浮培养细胞球数增殖变化、细胞球生长各时期特征：延迟(延迟) :细胞球分裂少，其长度与接种量大小和传代原种细胞球所处的生长期有关，对数生长期：细胞分裂活跃，细胞球数增加， 生长速率不变的直线成长期：细胞球生长和发育最明显的时期的晚时期培养液的消耗用尽，有毒代谢物质增多，缺氧平稳期：的生长几乎处于停止状态，细胞球

6、数的增加极少，开始死亡。 A，延迟的长度主要取决于传代时原种培养细胞球所处的成长期和输入细胞球数的多寡。 b .加入条件培养基可以缩短延迟期。 条件培养基：培养有会儿组织或细胞球的培养基。 如果缩短c.2次的中继时间间隔，则能够始终将悬浮培养的细胞球保持在对数生长期。 d .平稳期的细胞球混悬剂保留时间过长，会引起细胞球的大量死亡和解体。 操作注意事项：继承悬浮培养细胞球时，入液口孔径小，仅使用单细胞球或小细胞球块(2- 4细胞球)，使用吸管或注射器。 传代前，培养容器静置短时间，大细胞球团沉降，吸收上层混悬剂。 由此，能够多次制作良好的细胞球悬浮培养物。 4、细胞球生长测定应对如何建立的细胞

7、球悬浮体系进行动态测定，掌握其生长的基本规律，为继代培养或其他研究提供依据。 a .细胞球计数注意：由于悬浮培养的细胞球不呈游离单细胞球，用培养瓶直接取样很难进行可靠的细胞球计数。 用5%8%铬酸或0.25%果胶酶处理细胞球块的生长速度pP=(lnx-lnX0)/tX以t时间的细胞球密度、X0以开始细胞球密度、b、细胞球尺寸的测定技术(使用螺旋测微器) c、细胞球体积：即培养液每毫升细胞体积的毫升数表示。 d .细胞球的干燥重量和鲜重。 在预先称量的尼龙布中加入一定量的细胞球混悬剂，用水冲洗，除去附着在细胞球上的多馀水滴，然后称量，两者的差就是细胞球的鲜重。 一般来说，干燥重量是将离心收集的细

8、胞球移至预先称量的滤纸片中，然后在60下烘烤12h，再用干燥机蒸发制冷来称量。 细胞球的干燥重量和鲜重一般用每毫升的悬浮培养物的重量表示。 e、有丝分裂指数在一个细胞球群中，将有丝分裂的细胞球占总细胞球的百分率称为有丝分裂指数，指数越高分裂进行得越快。 一般采用美孚根染色法，先将组织用1molHCl水解作用60后染色，常规镜检，修正500个细胞球，经修正计算。 5、一个成功的悬浮细胞球培养系统必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，细胞球块小，一般在3050个细胞球以下，实际培养中由单细胞球构成的植物细胞球悬浮系很少。 均匀性好，细胞球形状和细胞球块大小大致相同。 悬浮系外观为大小均匀的小粒子

9、，培养基呈清澈透明，细胞球颜色呈鲜艳乳白或鹅黄色。 细胞球生长迅速，浮游细胞球的生长量通常在23天以下达到2倍。 影响悬浮细胞球生长的因素：起始愈伤组织质量：稀疏度好，增殖快，再生能力强。 其外观呈颜色鲜艳乳白或鹅黄色，细颗粒状，疏而易破碎。 接种细胞球密度：接种初期的细胞球密度过低时，延迟时间容易变长，悬浮细胞球的起始密度通常为0.52.5105个细胞球/毫升，低于此密度时，细胞球的生长变慢。 培养条件：方式、温度、传代周期、四、悬浮细胞球的同步化细胞球同步化是指同一悬浮培养系统的所有细胞球都经过细胞周期在云同步上的某一特定时期。在同一培养系统中，由于细胞球的不同步骤使悬浮细胞球的分裂、代谢

10、及大姨妈、生化状态等更加复杂，人们希望通过一定的技术途径，使同一培养系统中的细胞球保持相对一致的细胞学和生理学状态，工作中常用的处理方法： 1、物理方法1 ) 筛选法是根据细胞球的体积大小进行筛选，直接筛选相同周期的细胞球，Fujimura分离胡萝卜混悬剂47m膜过滤液31 m薄膜过滤收集10%ficoll添加等体积的培养基网上细胞球180g离心5min收集各细胞球层上加入的细胞球，用培养基清洗分别接种、2 )冷处理法。 低温处理可以提高培养体系中细胞球同步化的程度2，化学方法1 )在饥饿法悬浮培养细胞球中，切断细胞分裂所需要的营养成分和荷尔蒙激素的供给，细胞球就会停滞于G1或G2期，经过一定

11、时间的饥饿后，在培养基上再次加入该限制因子，静止细胞球就会分裂为云同步。 2 )若阻化剂法在一些DNA合成阻化剂中处理细胞球，在DNA合成前期保留细胞球，解除抑制，则可得到相同细胞周期中的细胞球。 常用的阻化剂有5 -氟脱氧尿核苷、5 -氨基尿核苷、羟基尿核苷等。 3 )有丝分裂抑制秋水仙碱处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般为0.2%，处理时间以4-6小时为宜，任何细胞球的同步处理，细胞球本身都有一定的伤害。 处理的细胞球缺乏一盏茶的生活力，不仅不能得到理想的同步效果，而且可能导致细胞球大量死亡，因此在进行同步处理之前，细胞球必须进行一盏茶的活化培养。 用于处理的细胞系最好处于对数生长期。 3

12、、单细胞球培养技术1、植物单细胞球培养的意义1、单细胞球无性系悬浮培养细胞球间的细胞球间存在遗传、大姨妈和生化差异，这些个的差异反映在它们的产量、质量、抗病虫害性和抗性等方面。 如果能筛选出高抵抗、高产、高质量的细胞球股票，一定能带来巨大的经济效果。 2、排除体细胞球干扰作用3、有利于细胞球活动跟踪观察2、单细胞球培养方法1、细胞球平板培养概念：制备的单细胞球混悬剂按一定细胞密度，接种1mm左右的薄层固体培养基进行培养。 被称为平板培养的主要技术要点：分离单细胞球：一般采用酶催化剂分离法，制备小细胞球块单细胞球混悬剂：分离的单细胞球在培养基上洗涤2次后，将密度调整至5105/ml，植板：将1份

13、密度调整后的单细胞球悬浊液和4份35的固体培养基充分混合均匀后，均匀铺设，放入培养皿栽培后的培养基完全凝固后，用残奥翅片或残奥膜封口膜密封培养皿，防止污染，在25暗的条件下培养3周，可形成肉眼可见愈伤组织。 植板率的评价：用能够形成细胞球块的单细胞球在单细胞球接种中所占的比例来表示。 植板率()(形成的细胞球块数/接种的细胞球数) 100修正公式中的每块平板的新形成的细胞球块数的修正方法有两种：一种是直接修正法，在修正量时把握适当的时间，即细胞球块用肉眼可以识别，但不在一起时进行留心。 二是感光法，在暗室红光下将相片纸放置在想要校正数的培养皿下面，在其上面放置光源，将培养皿中的细胞球块印刷到相

14、片纸上，冲洗摄影图片校正数。 2、护理培养概念：一种在愈伤组织或植物离体组织中护理单细胞球使其生长增殖的单细胞球培养方法。 3、微池培养的概念：在人造的中制备一个池，将单细胞球培养到池中少量的培养基中，使其分裂增殖形成细胞球块的方法，称为微池培养。特点： (1)显微镜下可追踪单细胞分裂增殖形成细胞球块的全过程；(2)培养基少，营养和水分难以保持，pH波动幅度大，培养细胞球只能短期分裂。 4、其他单细胞球培养技术对a饲养层培养基技术饲养细胞球经放射性射线处理后，将饲养细胞球和培养细胞球混合种植板，照射的细胞球对培养细胞球发挥饲养作用。 b双层滤纸植板培养方法、培养基、饲养层细胞球、护理滤纸层、转

15、送盘滤纸、培养细胞球， 4 .植物细胞球大规模培养1 .概要2 .培养系统3 .植物细胞球规模培养技术的要点技术要点4 .提高细胞球次级代谢产物的途径5 .细胞球规模化培养的相关技术问题，introduction primarymetabolitesarecompoundsneededinthebasicprocession proteinsandlipids.secondarymetabolitesarecompoundsproducedinplantsthatarenotnecessaryfortheplantsbasicfunctions.somes eervice caldefense

16、againstmicrobesandanimals .type : secondarymetabolitesareusedinthepharmaceuticalinded as flavour ants and dyes，第二代消费者指示符和指示符， 与性能.次级元件安全级别，卡片级别，标准组件。steroidal compounds。 李时珍(1593 )列入本草纲目的1892种药物大部分是植物药物，至今约有25种法定药物来源于植物。 其药物的有效成分均为副产物。 许多植物次级代谢产物是优秀的食品添加剂和名贵化妆品原料。 部分是生物毒素的主要来源，可用于杀虫、杀菌，但对环境和人畜无害，是理想

17、的环保产品。 例如从胡萝卜、万寿菊中提取色素从黄菊中提取挥发油类从栀子中提取果酸：果酸含有维生素c、柠檬酸等维生素。 主要作为食品的调味料使用，化妆行业用于制作护肤品和洗发露等，美容院作为换肤液使用。 3规模化细胞球培养为植物次生产品的理想途径，保护生态环境提高生产效率发展新型生物技术产业，对植株和细胞球培养的紫草宁含量进行比较，4、植物细胞培养特性1植物细胞球比微生物细胞球大得多，有细胞里肌肉细胞贴壁细胞球，抗扭， 抗剪断力弱的2培养过程的生长速度慢，容易被微生物污染，需要抗生素的3细胞球生长中期及指数期容易凝聚成直径350 jjm 1400 pm的团块，悬浮培养难的4培养需要供氧，培养液的黏性系数大：由于有5集团效应的6细胞贴壁， 培养细胞球产物滞留在细胞球内，产量低的7细胞球培养过