第七讲 RNA的提取原理及提取技术_第1页
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文档简介

1、、RNA的提取原理和提取技术、RNA的分类： rRNA核糖体核糖核酸tRNA转移核糖核酸mRNA信使核糖核酸的典型哺乳动物细胞球包括10-5ugRNA，其中rRNA占80%-85%(28S、18S和5S) tRNA， 提取RNA过程中防止RNA酶催化剂污染的措施：1所有玻璃容器用电烤箱(186 )烘4-6h，不能高温灭菌时，用0.1C水溶液处理，用干净的蒸馏水冲洗2使用的水先用0.1C37处理12h以上，再经高压灭菌3 戴口罩进行操作，经常更换，4 RNA阳离子电泳槽用污垢清除剂清洗，用水清洗，乙醇干燥后，在室温下用3%H2O2溶液浸渍10分钟，最后用0.1C处理过的水完全清洗的5个作业区域从

2、进行通常的微生物实验的区域分离，成为单独的作业区域影响RNA提取的因素，材料：不要使用反复冻融材料材料来源困难，实验需要一定的时间间隔。 如果要先将材料储存在样品储存液中，多次提取可以保存在70或20中，请分多次保存液氮，长期保存，70短期保存。 影响RNA提取的因素，样品破碎和裂解：根据材料选择不同的处理方法：培养细胞球：通常可以直接加入裂解液裂解的酵母和细菌：一般的三唑可以直接裂解，对某些特殊材料可以酶催化剂或机械方法裂解的动植物组织： 期间动作迅速，样品保持冷冻状态。 注意：样品量合适，保证分解成一盏茶。TRIzol :主要成分是苯酚。 苯酚的主要作用是分解细胞球，使细胞球中的蛋白质、核

3、酸物质解聚而释放出来。 由于苯酚能有效地改性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活力，因此在三唑中添加8 -羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等抑制了内因和外因RNase。 影响RNA提取的因素、纯化：用三氯甲烷提取纯化时，必须与一盏茶混炼，且操作迅速，LiCl沉淀等经典纯化方法虽然经济，但用操作时间长、容易引起RNA分解的亲和色谱法法进行纯化。 RNA提取方法、异硫氰酸胍/酚法原理：异硫氰酸胍使核蛋白质复合物解离，RNA释放于溶液中，用酸性酚/三氯甲烷混合液提取，低pH的酚将RNA加入水相，蛋白质和DNA仍保留于有机相中，即可完成RNA的提取。 操作步骤：1液氮研磨组织或细胞球； 加入trizol试

4、剂，在保证RNA完全性的同时破碎细胞球，加入溶解细胞组分的3三氯甲烷萃取，离心分离水相和有机相，用萃取含RNA水相的4异丙醇沉淀得到RNA样品。 mRNA的提取、完整的mRNA分离纯化是进行分子克隆、基因表达分析的基础。 DNA或RNA浓度、纯度及相对分子量的测定、1仪器测定紫外分光光度校正ssDNA=33 (OD2600D310 )稀释倍数dsDNA=50(OD2600D310 )稀释倍数ssRNA=40 (OD2600D310 )稀释倍数DNA纯度的判断A260/A280=1.8 1.9是RNA污染1.6是蛋白质、苯酚等污染RNA纯度的判断A260/A280 1.72.0 1.7是蛋白质，苯

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