实验三 植物组织RNA的提取与分析

1、1,实验三 植物组织rna的提取与鉴定,2,（1）通过本实验，了解rna的结构和特点。 （2）学会使用trizol法提取植物总rna。 （3）学习和掌握总rna的检测实验技术和实验原理。,一、实验目的,二、实验原理,rna的提取是进行分子克隆和基因表达分析等研究的基础。但rna很容易被内源及外源的rnase降解，所以要得到未被降解的、不含dna与其它杂质的rna是进行分子生物学研究的前提。 目前较为成熟的分离rna的方法有许多，用于植物细胞总rna的提取主要有苯酚法、异硫氰酸胍法、氯化锂沉淀法、sds/酚抽提法，或应用商品化的trizol试剂和qiagen等各类试剂盒进行提取。但由于植物细胞具

2、有坚硬的细胞壁，内含较多的多糖、脂质、多酚等次生代谢物，同种植物的不同组织和不同植物的同种组织材料，其rna的提取方法也会有很大差异。适宜的rna提取材料处理方法也不尽相同。,二、实验原理,trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总rna的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持rna的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，rna处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀rna。 用这种方法得到的总rna中蛋白质和dna污染很少，可以用来做northern，rt-pcr，分离mrna，体外翻译和分子克隆等。,5,三、仪器和试剂,1、仪器： 高速冷冻离心机、微波炉

3、、稳压电源、水平电泳槽、凝胶成像系统。 2、材料与试剂： 液氮、trizol、氯仿、异丙醇、70%乙醇、depc处理的蒸馏水、琼脂糖、1tae、上样缓冲液。,6,四、实验步骤,1、rna的提取 （1）称取0.1g新鲜植物叶片（小麦、烟草、吊兰等均可）置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末，快速将全部粉末转入1.5ml的无rna酶的离心管中。 （2）向离心管中快速加入1mltrizol，充分混匀后室温下放置5min。 （3）4，12000r/min离心10min。 （4）吸取上清液置于一个新的1.5ml的无rna酶的离心管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡1min，室温放置3min。,7,四、

4、实验步骤,1、rna的提取 （5）4，12000r/min离心10min。 （6）吸取上清液置于一个新的1.5ml的无rna酶的离心管中，加入600ul异丙醇，-20放置30min。 （7）4，12000r/min离心10min。弃去上清液。 （8）向离心管中加入1ml70%乙醇，漂洗沉淀物。4，5000r/min离心3min。弃去上清液。（此步可省略） （9）待沉淀物自然干燥后，加入20uldepc处理的蒸馏水，充分溶解后，即为rna溶液。,8,四、实验步骤,2、rna电泳检测 （1）1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖，加入20ml 1tae缓冲液，加入20ul甲醛溶液（可省略），在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。 （2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。,9,四、实验步骤,2、rna电泳检测 （3）上样电泳：将5lrna样品溶液和5l上样缓冲液混匀后，上样，100v稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。 （4）照胶、拍照：将