发酵——参数检测.ppt

1、第七章 微生物培养过程的参数检测,在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据。,黑箱 灰箱,检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、 双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等,检测代谢中间物，分析代谢流向、RNA检测,一 参数在线检测,由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求： 插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据） 传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好） 传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏） 传感器性能要稳定，受气泡影响小。,带计算机数据采集与控制的生

2、物反应系统,P188,介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理,pH电极 溶氧电极 它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极,（一） pH测量,pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过程控制是一个非常重要的参数。,1、pH的定义,影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式上的麻烦 引进pH=-lgH+ H+=0.00001时 用pH5表示,2、pH测量方法,pH试纸曾经是一种广泛采用的方法 优点：方便，易操作 缺点：它主观性较强 质量差异，不同厂家不同批号的pH试纸测出的pH值会有较大的差别，有时甚至达0.51。 对于一些要求较高

3、的场合就适用,pH试纸 pH电极,（1）pH电极测量原理,pH电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电池，该电池的表达式可写为： 参比电极 溶液X 指示电极 该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函数。,E=E0- ln1/ =E0-2.303 pH,式中E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电位差计的E值可测出pH值。,甘汞电极（a）232型（b）217型,1导线；2加液口；3-KCl溶液；4素烧瓷芯；5铂丝；6Hg；7Hg2Cl2 一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套

4、一根小玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘汞不会漏失，小管和大管之间充满KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。,参比电极,由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电池可表示为Hg(L) Hg2Cl2(S) Cl-(L) 电极电位产生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：,由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活度有关而不受被测溶液的酸碱度影响,（2）指示电极,对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的电极都

5、可用来测定溶液的pH。,离子选择性电极的结构,离子选择性电极的结构,其中敏感性膜部分随组成材料的不同而各有特色。测定pH值的玻璃电极的敏感膜是厚度为101103mm的玻璃薄膜，其电阻为50500m。,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,取样系统,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,pH的检测,常用pH检定仪为复合pH电极，具有结构紧凑，可蒸汽加热灭菌的优点。,工作原理：利用玻璃电极与参比电极浸泡于某一溶液时具有一定的电位，其pH可表示为：,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,pH的检测,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,pH的检

6、测,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,pH的检测,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,pH的检测,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,溶氧浓度的检测,常用检测方法为溶氧电极法。,阴极还原: O2+2H2O+4e-4OH- 阳极氧化: 4Ag+4Cl-4Ag+4Cl-+4e- 总反应: O2+2H2O+4Ag+4Cl-4OH-+4AgCl,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,溶氧浓度的检测,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,溶氧浓度的检测,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,溶解CO2浓度的测定,

7、溶解CO2浓度的检测原理是利用对CO2分子有特殊选择渗透性的微孔膜，并使扩散通过的CO2进入饱和碳酸钠缓冲液中，平衡后显示的pH与溶解的CO2浓度成正比，由此可测出溶解CO2浓度。,CO2电极结构,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,氧化还原电位（ORP）的检测,ORP的检测原理是基于溶液中的金属电极上进行的电子交换达到平衡时，具有相应的氧化还原电位值。表示式为：,排气的氧分压的测定,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,气体中氧浓度的检测方法主要有磁氧分析、极谱电位法和质谱法。,排气的CO2分压的测定,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,排气中C

8、O2浓度常用检测仪有红外线二氧化碳测定仪和二氧化碳电极。 CO2气体在红外2.62.9103和4.14.5103nm之间有吸收峰，根据朗伯比尔定律：,细胞浓度的测定,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,全细胞浓度的测定,细胞浓度在线检测浊度计,细胞浓度的测定,生化过程常用检测方法及仪器,主要参数检测原理及仪器,活细胞浓度的测定,荧光测量活细胞装置图,二 参数的离线检测进展,利用高效液相（HPLC）分析代谢中间产物 通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的放矢的控制发酵过程,三.发酵过程的自动控制,发酵过程的自动控制是根据过程变量的有效测

9、量和对发酵过程变化规律的认识，借助于由自动化仪表和计算机组成的控制器，控制一些发酵的关键变量，达到控制发酵过程的目的。,对发酵过程进行自动控制的优点,提高产品的得率； 改进产品的质量； 降低后续加工过程的损耗； 在整个操作过程中能稳定的保持最优条件； 提高对原料质量波动的适应性； 减少认为因素的影响； 提高工厂的生产效率； 降低能耗； 降低分析和操作成本。,存在的问题,发酵是一个较复杂的生化反应过程，大滞后和时变性是其主要特征。 传感器 不能蒸汽灭菌； 会和产品发生反应； 过分敏感。,基本的自动控制系统(control loop),前馈控制(feedforward control) 后（反）馈

10、控制(feedback control ) 自适应控制(adaptive control),1、前馈控制,如果被控对象动态反应慢，并且干扰频繁，则可通过对一种动态反应快的变量（干扰量）的测量来预测被控对象的变化，在被控对象尚未发生变化时，提前实施控制。这种控制方法叫做前馈控制。 如，对温度的控制，在系统中，冷却水的压力被测量但不控制，当压力发生变化时，控制器提前对冷却水控制阀发出动作指令，以避免温度的波动。,2、反馈控制,反馈控制系统如图所示，被控过程输出量x(t)被传感器检测，以检测量y(t)反馈到控制系统，控制器使之与预定的值r(t) （设定点）比较，得出偏差值e 。然后采用某种控制算法根

11、据偏差e确定控制动作u(t) 。 开关控制； PID控制； 串（联）级反馈控制； 前馈/反馈控制。,开关控制,如发酵温度的开关控制系统是通过温度传感器检测发酵罐内温度，如温度低于设定点，冷水阀关闭，蒸汽或热水阀打开；如温度高于设定点，蒸汽或热水阀关闭，冷水阀打开。控制阀的动作是全开或全关，所以称为开关控制。,PID控制,当负荷不稳定时，可采用比例（P）、积分（I）、微分（D）控制算法，及PID控制。 P、I、D控制器的控制信号，分别正比于被控过程的输出量与设定点的偏差、偏差相对与时间的积分和偏差的变化速率。,P,串联（级）反馈控制,串联反馈控制是由两个以上控制器对一种变量实施联合控制的方法。

12、如溶解氧在发酵罐中的控制。作为一级控制器的溶氧控制器根据检测结果，由PID算法计算出控制输出、但不用它来直接实施控制动作、而是被作为二级控制器的搅拌转速、空气流量和压力控制器当作设定点接受，二级控制器再由另一个PID算法计算出第二个控制输出，用于实施控制动作，以满足一级控制器设定的溶氧水平。,溶解氧水平的串联反馈控制,前/反馈控制,如前馈/反馈控制应用于污水处理系统。,污水处理的前/反馈控制系统 SS：悬浮固体含量传感器 FRC：流量记录和控制器,3、自适应控制(adaptive control),发酵过程是复杂的和不确定的过程，对发酵过程动态特性无法确定数学模型。对于这样过程的控制，须提取有

13、关的输入、输出信号，对模型和参数不断进行辩识，使模型逐渐完善，同时自动修改控制器的控制 动作，使之适应于实际过程。,发酵自控系统的硬件组成,传感器 变送器 执行机构 转换器 过程接口 监控计算机,发酵自控系统的硬件组成,发酵过程常见控制系统,1、Feed control,Schedule of fermentation,2、Temperature control loop,3、pH control loop,4、pO2- and rpm-control,5、Antifoam control,例：鸟苷生产,在鸟苷发酵中，发现发酵到40小时后鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖,使发

14、酵过程pH下降，补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？ 于是进行以下一些测定与分析,什么因素导致pH下降？,测定以下中间物,发酵后期丙酮酸积累,2、氨基酸的积累 在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和NH4+积累。,氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在8小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在48小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的12.6倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维

15、持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。,3、分析原因 发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸 丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（GS）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。,恶性循环,（二） 代谢流迁移的酶学证明 糖代谢途径关键酶 糖酵解途径（EMP） 在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶： 磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶 磷酸果糖激酶的时序分析,12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以PFK的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞

16、生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对酶活增加，这表明此时通过EMP途径的糖代谢通量已有了明显的增加。,丙酮酸激酶时序分析,丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素,磷酸戊糖途径（HMP）关键酶,磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化6磷酸葡萄糖脱氢生成6磷酸葡萄糖酸内酯。,6磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析,由图可以看到，早期6磷酸葡萄糖脱氢酶活力很

17、高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持EMP和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到40小时后，6磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在HMP途径通量下降而EMP途径通量增加。,三羧酸(TCA)循环的关键酶,三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸循环中

18、的第一个限速步骤。,柠檬酸合成酶时序分析,从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量并没有发生明显的增加。即代谢流迁移发生在EMP和HMP之间，主要是由于EMP和HMP途径之间的分配平衡被打破所造成的。EMP途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。,丙氨酸脱氢酶的时序分析,在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节

19、点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。,结果加入EMP途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量,（三）与产物合成相关的酶和中间物测定,例：螺旋霉素生物合成的代谢研究,图3 螺旋霉素生物合成代谢网络途径,图1 螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图,哪个代谢中间物过多积累,在发酵后期有FO-积累， 要减少FO-转化为FO-必须降低C3酰化酶的活力，但这与SP、SP合成有矛盾 在发酵结束时， SP-还有一定的积累，如能最大限度的转化为SP-、SP-，即加强步骤3对发酵效率和发酵效价是有积极意义的。而FO-、NSP-的最终积累则导致流量浪费，因为

20、这两种物质最终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤4的通量。但由于这几个步骤的转化都是由C3酰化酶催化反应，这给改变通量带来一定的困难。,图2 有机酸前体的动态流量分布图,在图2中，乙酸和丁酸在从40小时开始积累并在64小时达到最高值，对照图3螺旋霉素生物合成代谢网络途径9，我们可以推测在发酵中前期在图3中的步骤1也即大环成环步骤有一定程度的“瓶颈”影响，从而导致乙酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺旋霉素的效价。 我们测定了内酯环合成相关的酶活前体的活化,酰基激酶和酰基CoA合成酶活性趋势 测定酶活并建立酶活趋势曲线。 分析：两种酶在发酵过程中都有两个活性高峰期,但出现的时间相差很大。 酰基激酶的活性高峰期主要集中在发酵中前期 酰基CoA合成酶的活性高峰期主要集中在发酵中后期。此外，酰基CoA合成酶的活性远小于酰基激酶的活性。,酰基激酶在发酵初期出现一个活性高峰，推测其参与了初级代谢；后一个活力峰出现在发酵中期，且与酰基CoA合成酶的第一个活力峰出现时间相一致，意味着酰基激酶对次级