污染环境的生物修复

1、陈英旭 教授,污染环境的生物修复,浙江大学环境与资源学院,内容,我国环境污染现状 污染环境修复理论 污染环境生物修复的机理研究 污染环境风险与修复研发展望,我国环境污染现状,大气复合污染加剧，酸雨沉降频繁，严重危害生态系统和人体健康,SO2维持高含量,NOx持续上升,大气细粒子； PM2.5美国2.6倍,VOCs：室内空气污染,POPs：苯并a芘超标，肺癌发病率增加,Pb等：39%儿童血铅超过铅干预标准,O3：200ppb，影响作物，森林、人肺,混合酸雨：69-100%；pH3.8-5.0; 损失70亿元/年,国家重大需求,水环境氮、磷、有机物等复合污染严重，水质性缺水普遍,太湖流域80%河道

2、污染，60%不能饮用,浙江：36/88县；84%平原河段不能饮用,苏、浙、沪16县井水氮超标：38-58%,广州河段：IV类；优控三致物36/300种,广州饮用水：优控三致物24/103种,广州及澳门河段底泥：POPs高风险区,耕地土壤环境氮磷累积、重金属、有机污染物复合污染剧增，“定时炸弹”隐患多,太湖流域年排放量：4545 kg N/km2； 46.5 kg P /km2 ； 1/3土壤受DDTs和HCHs污染。,浙江：万亩良田，万亩菜地，Cd/Pb/Hg/ As/ Cu/ Zn 等复合污染，与农药、POPs复合污染,江苏: 1700万亩耕地重金属污染,广、深、珠、中、佛等郊区：Cd/Hg

3、/Zn,广州:Cd 82%, Hg 77%;佛山：73%, 97%,农药、POPs,农、水产品污染物超标，品质下降，生物资源衰退,Pb/Hg/Cd/As超标6.8亿公斤，广州90%,硝酸盐和亚硝酸盐超标：百万吨；4倍,人乳DDTs和HCHs：美国100倍,POPs：水产品积累,蔬菜、茶叶、粮食农药残留、超标,生物资源衰减,城市污灌区的癌症发病率高：10多倍,环境复合污染,区域环境质量恶化,生态安全,环境安全,食物安全,人体健康,区域社会经济可持续发展,经济发展,投资环境,社会稳定,中国生态与环境的现状,已进入持续性生态资源短缺和大范围复合性环境污染的新阶段。,我国生态与环境的总现状,污染环境修

4、复理论,生物修复的定义 生物修复是指利用土壤中的各种生物植物、土壤动物和微生物吸收、降解和转化土壤中的污染物，使污染物的浓度降低到可接受的水平，或将有毒有害的污染物转化为无害的物质。,污染环境修复理论与技术,化学,生 物,工程,原位钝化 原位固定 原位失活,微生物,植 物,原位 离位,原位,离位,泥浆,固体,强化,动物,土壤键合点位,土壤污染物的迁移过程,新固相,通过改变生物或非生物条件,修复剂,新键合点,土壤溶液,1、土壤生物修复（Soil Bioremediation),利用土壤中原有的或引入的功能生物体，包括植物、动物和微生物，单独地或联合地吸收、降解或转化土壤中的污染物，使污染物的浓度

5、降低到可接受的水平或将污染物转化成无害物质，并恢复土壤功能的过程或技术。,自然生物修复和人工生物修复,2、微生物修复,高效降解菌株的筛选 拟降解对象的生物可降解性研究 基因工程菌构建 土壤微生物功能基因开发,微生物修复研究热点土壤微生物功能基因开发,土壤中蕴含着极其丰富的微生物资源，但目前人们对此知之甚少。在还无有效的手段完全分离的情况下，开发土壤微生物的各种功能基因，从而将其克隆出来，这已经成为一种土壤微生物修复资源开发十分重要的的基础研究策略。,原位PCR技术 功能基因探针检测技术 反转录PCR技术（RT-PCR） 荧光原位杂交技术（FISH） 荧光定量PCR技术（real time PC

6、R） 环境功能微生物基因芯片,3、植物修复,植物挥发 植物过滤 植物钝化 植物提取,植物修复研究热点,超积累植物的筛选及其种子资源和数据库的建立； 超积累植物吸收累积重金属的生理生化及分子生物学机制研究； 超积累植物重金属吸收富集关键基因的克隆； 环境友好的重金属污染土壤植物修复的微生物、化学和生态调控技术； 植物修复的示范性基地的建设和推广。,植物修复新发展,络合诱导植物吸取：Chelate-induced phytoextraction 植物转化： Phytotransformation 植物刺激： Phytostimulation 根际修复： Rhizo-remediation,特定形态

7、修复(SSR),生物有效形态减量(BSR) 生物有毒形态转化(BST),超积累植物的筛选,5,18,Zn,36,Ni,6,12,Mn,3,5,Pb,11,24,Cu,12,26,Co,2,2,Cd,2,3,As,Number of families,Number of species,Metals,5,18,Zn,36,318,Ni,6,12,Mn,3,5,Pb,11,24,Cu,12,26,Co,2,2,Cd,3,As,Number of families,Number of species,Metals,世界上发现的超积累植物种类,一些超积累植物和累积金属的最大含量,国内一些学者发现的超积

8、累植物,我们发现的锰超积累植物商陆,湘潭锰尾矿废弃地商陆对锰的积累,POPs 污染环境,5、POPs污染环境的修复,阻 挡,净化,固定（改良剂）,物理性屏障,固化,去除,“挖填转移”问题,原位,离位,VOCs挥发,土壤混合植物挥发,生物修复,植物支持的生物修复,生物反应器,土壤冲洗,接种功能微生物的修复,有机污染的植物修复,吸收,光降解,hn,转运,植物挥发,植物转移,根际降解,植物同化持久性有机污染物（POPs）的过程及机理 生物与持久性有机污染物的相互作用过程与机理 POPs对生物的毒害机理 特定POPs的分析测定方法研究 特定POPs生物修复的工程技术开发与应用,有机污染的植物修复研究热

9、点,6、植物支持的生物修复,利用细菌和真菌的原位生物降解 限制因素 养分 有效性 低生物量 低氧 改进：根际条件,每公顷根长300, 000 km (相当于绕地球7.5圈) 改进根际条件的途径 养分 有效性 高生物量 增氧,“根际修复”,根际修复：根际环境工程,7、人工湿地,生物修复机理研究,A,B,C,D,E,植物超积累重金属的机理研究,根系质子分泌 根分泌物种类（苹果酸、柠檬酸等）与分泌机制 根土微界面反应 根际微生物的作用机制,根际环境行为,mobilization,重金属根际行为,根际环境特征 根系分泌物的组成、络合行为 根际矿物质与污染物化学行为 根际生物学特征,重金属胁迫根系分泌物

10、发生变化,保留时间（min）,图2 小麦根分泌物在重金属胁迫下的毛细管电泳图 ig.2 Capillary electrophoresis figure of wheat root exudates at 254 nm,根系分泌物与重金属的络合行为,根系引起矿物质结构变化,图5针铁矿的XRD图 Fig.5 X-ray diffractograms for goethite,图4无定形氧化铁的图 Fig.4 X-ray diffractograms for amorphous Iron (III) oxides.,Intensity,2-Theta(。),2-Theta(。),图6镉污染下红壤不

11、同作物氨化作用变化情况 Ammonification of various crops in the soil conaminated by Cd,图7镉污染下红壤不同作物硝化作用变化情况 Nitrification of various crops in the soil conaminated by Cd,根际微生物活性变化,Different microbial populations in a community 不同根际样品,DNA extraction and PCR amplification DNA提取与PCR扩增,Mixed 16S rRNA gene copies 16S

12、rRNA基因片断,Separate by cloning in E. coli or DGGE DGGE分离16S rRNA基因片断,Sequence 回收测序,Phylogenetic Identification 种群鉴定,根际微生物分子生态,图9,不同根际土壤主成分分析结果图,香根草,油菜,芥菜,图,2,不同土壤总,DNA,扩增后的电泳图,对照,图8 PCR,所得不同植物根际土壤,16S rDNA,的,DGGE,分离结果图,重金属吸收、累积和存在形态,重金属的主动吸收和被动吸收机理 重金属吸收的离子通道和转运蛋白 重金属在植物体内的分布定位 重金属在植物体内累积的分子形态,根系吸收 主动

13、与被动吸收 在重金属污染土壤上，植物对重金属的吸收由于环境浓度差异大而存在被动吸收；Knight 等（1997）认为超积累植物对土壤溶液中Zn可能存在主动吸收过程。 离子通道或转运蛋白 锌转运蛋白(ZIP)和铁转运蛋白(ITR1)对根吸收土壤中Zn和Fe起重要作用； ZIP和ITR1也具有吸收转运Mn(II), Co(II), Cd(II)或Cu(II)等重金属离子的潜力。,Uptake and sequestration,木质部薄壁细胞转载到导管的能量可能来自木质部薄壁细胞膜上的H-ATPase产生的负性跨膜电势 在导管中运输的能量主要来自根压和蒸腾拉力 有机分子在超积累植物体内重金属运输中

14、有重要作用，用X-射线吸收精细结构分析法( EXAFS) 研究,发现印度芥菜伤流液中有机酸参与了Cd 在木质部的运输,木质部运输,Xylem transport,卸载与组织分布,从木质部卸载到叶细胞(跨叶细胞膜运输) 在组织水平上,重金属主要分布在表皮细胞、亚表皮细胞和表皮毛中,Unloading and tissue distribution,细胞分布定位,细胞壁 液泡 线粒体 叶绿体 高尔基体 其他,Trafficking and sequestration,液泡常被认为是重金属贮存的主要场所， 用电子探针观察了遏蓝菜属T.caerulenscens观察到根中的Zn大部分分布在液泡中。,细

15、胞壁是重金属离子进入的第一道屏障,它的金属沉淀作用是一些植物耐重金属的原因。蹄盖蕨属（Athyrium yokoscense)植物吸收的Cu大约有70-90%位于细胞壁。,表5DNP和Na3VO4对理海州香薷和鸭跖草铜吸收的影响 Table 5Effect of DNP and Na3VO4 on Cu uptake of E. splendens and C. communis,解偶联剂2,4二硝基苯酚（DNP）和P型ATP酶抑制剂钒酸钠（Na3VO4）对海州香薷和鸭跖草铜吸收均有一定的抑制作用，说明两种植物对铜可能存在主动吸收。,重金属的主动吸收？,图10钙离子通道抑制剂对海州香薷和鸭跖草

16、铜吸收的影响 (mg/kg) Figure 10.Influence of cycloheximide on Cu uptake in E. splendens and C. communis,钙离子通道抑制剂LaCl3对海州香薷铜吸收有抑制作用，而对鸭跖草铜吸收没有抑制作用，说明海州香薷铜吸收与钙离子通道密切相关，而鸭跖草铜吸收则不通过钙离子通道进行。,吸收的离子通道?,图11不同铜浓度下缺铁对鸭跖草铜浓度(mg kg-1)的影响 Figure 11 Cu concentration (mg kg-1) in C. communis response to Fe deficiency,图12

17、鸭跖草根质膜Fe ()还原酶的定性表征 Figure 12. Qualitative visualization of Fe () reduction along roots of C. communis,缺铁在不同浓度铜下都显著促进鸭跖草对铜的吸收。缺铁诱导9天鸭跖草同时出现铜吸收和Fe ()还原酶（FCR）活性峰，鸭跖草对铜的吸收可能与根质膜 FCR活性密切相关。,Control -Fe,根质膜蛋白作用,Fig. 13 ultrastructure of root cells of Elsholtzia splendens Naki and corresponding EDX-spectr

18、a （A: dark precipitates at the inner side of cell wall, 6000; a: corresponding EDX spectrum; B: needle-shaped precipitates in the vacuole, 7500, b: corresponding EDX spectrum,细胞壁和液泡是海州香薷根细胞中铜的主要分布部位,重金属的亚细胞定位,图14 锰在超积累植物叶片SEMEDX线扫描 Fig. 14. Mn location in leaf of Mn hyperaccumulators Phytolacca acin

19、osa using SEM-EDX,Mn在超积累植物叶片的分布,Mn在叶的维管束部分含量最高，其次是栅栏组织和海绵组织，在表皮细胞含量较低。,图152M（A）和500M（B）铜处理鸭跖草根蛋白质粗提液的Sephadex G-50层析(280nm检测)及收集液铜含量 Fig. 15. Gel filtration of protein crude extract from Commelina communis root treated with 2M (A) and 500M (B) Cu on Sephadex G-50 ( determined the peak at 280nm) and

20、Cu content in fractions,利用Sephadex G-50对鸭跖草铜结合物质进行分离（280nm在线检测蛋白峰），同时测定每收集管中铜含量。结果表明蛋白质是鸭跖草中铜的主要结合物质之一。,重金属存在形态,图16鸭跖草根、茎和叶Cu的K边外延X-射线吸收精细结构谱（EXAFS）傅立叶变换曲线 Figure16 . The Fourier transform spectra of Cu K-edge EXAFS in root, stem and leaf of C.communis,K边外延X-射线吸收精细结构谱（EXAFS）傅立叶变换曲线通过WinXAS进一步的曲线拟合，可

21、以得到每个配位层中原子的种类、数目以及配位原子与中心原子间距等参数。,可以看出，Cu-S所占的比例在增加，根部几乎是Cu-O，到了叶子，Cu-S占的比例很大。表明Cu的近邻结构发生了很大的变化。,鸭跖草和参比物质中Cu的K边EXAFS分析结果 (第一壳层的拟合) （FT ： K2 weighed, FT window : Gaussian 10）,图17鸭跖草根、茎和叶的X射线吸收近边结构谱 (XANES) Fig.17. The normalized XANES spectra in root, stem and leaf of C.communis,从XANES看，从根到茎到叶，谱向低能方

22、向移动，同时主峰(1s-4p)的强度降低，表明Cu的价态和配位结构发生了很大的变化：Cu的价态降低，分布更加弥散，无序度增加。,有机物质（生物体）的吸持锁定作用,2、POPs的化学物理化学修复,吸附阻挡POPs孔隙扩散锁定,玉米对PAHs的吸收作用,植物对PAHs的吸收,玉米、水稻对PAHs的吸收,Treatment,112 KD 96 KD 66 KD 45 KD 18KD,PI4,PI7,PI4,PI7,CK,PAHs胁迫下玉米叶蛋白质双向电泳图谱,有机污染物胁迫下植物蛋白变化,根际降解和调控,0,20,40,60,80,100,0,10,50,250,500,1000,菲的处理浓度,菲在

23、根际土壤的浓度,(mg/kg),三叶草,黑麦草,对照,菲在不同植物根际的降解情况,3、微生物修复,微生物对有机污染的修复 1、有机污染物进入微生物细胞的过程 主动运输、被动扩散、促进扩散、基团转位、胞饮作用 2、微生物对有机物的降解,芳香烃降解fpg 基因的构建与表达策略,pGEX 4T digested by BamHI and EcoRI,Recombinant pGEX-fpg,pT-fpg vector digested by BamHI/ EcoRI and fpg gene was recovered,fpg 融合基因克隆与构建结果 PCR products of TP-PCR m

24、ethod,1 2 M,2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp,1 2 3 M 4 5 6,构建结果,表达载体构建结果,重组pGEX4T-fpg 载体构建及fpg基因的表达结果 Construction of pGEX4T-fpg and fpg expression results,1 2 3 4 5 6 7 8,M 1 2 3 4 5 6 7 8 M,116.0kD 66.2 kD 45.0 kD 35.0 kD 25.0 kD 18.4 kD 14.4 kD,携带有fpg融合基因表达蛋白的大肠杆菌（左）和野生菌（右）荧光显微镜下形态,4、水生生物对富营

25、养化物的修复,微生物对N、P营养物的修复 微生物脱氮 氨化作用、硝化作用、反硝化作用 微生物脱磷 植物对N、P营养物的修复 生态系统对N、P富营养物的修复,生物去除水中的N、P,环境风险与修复研发展望,污染土壤的植物修复示范基地,Phyto Demo Plots September 2000,Phyto Demo Plots September 2001,Effectiveness- Hartford, CT,利用印芥菜修复Pb污染土壤,Week 1, initial planting,Week six,土壤修复基地,863项目“重金属污染土壤的植物修复技术” 开发出一种治理土壤污染的化学调控剂（发明专利申请号200310108910.3 ） 开展化学调控剂诱导的植物修复技术研究 化学调控剂生态风险评估 修复示范基地建设,植物修复与资源化,选择合适场地 种植专性植物 活化修复对象 促进吸收富集 收获加工成品,环境污