第十章 亲子鉴定.ppt

1、第十章 亲子鉴定,第一节 概述 亲权鉴定（indentification in disputed patermity）：是指应用医学、生物学、和人类学的方法检测遗传标记，并依据遗传学理论进行分析，从而对被检者之间是否存在生物学亲缘关系所作的科学判定。 亲子鉴定：判断父母与子女之间是否存在生物学亲缘关系，称为亲子鉴定。 父权鉴定：在亲子鉴定中，母子关系确定，要求判断争议父亲和子女间是否存在亲子关系。,一、亲子鉴定的类型 1、涉及民事纠纷的亲子鉴定 （1）涉及婚生或非婚生子女抚育责任或财产继承诉讼案 （2）怀疑产院调错婴儿的诉讼案 2、涉及刑事案件的亲子鉴定 （1）强奸案或违纪性犯罪案件对儿童（或

2、胎儿）亲生父亲的确定 （2）碎尸案中的身源鉴定 （3）杀婴、拐骗儿童等案件中孩子身源的认定 3、涉及行政事务的亲子鉴定 （1）移民涉外公证 （2）失散亲人亲缘关系的认定 （3）计划外生育责任人的确认及其子女户籍的注册,二、亲子鉴定的依据 亲子鉴定的依据包括遗传性状、妊娠期限、性交能力及生殖能力三个方面。其中遗传性状是亲子鉴定最主要的依据。 遗传性状：是生物体表现的一切形态特征、生理特征、代谢类型的统称。 单位性状：其中可检测的、由遗传决定的特征，并能够按预期的方式从一代遗传给下一代的性状，在遗传学上称为单位性状。 遗传标记（genetic marker）：这种具有相对差异的单位性状作为标志来识

3、别携带它的个体、细胞和染色体或用以研究细胞、个体、家系、群体的遗传方式时称为遗传标记。,应用于法医学鉴定的遗传标记大致可作如下分类： 血液细胞表面的 基因产物水平遗传标记 （红、白、血板） 遗 血液蛋白质的 传 标 DNA序列多态性 记 DNA水平遗传标记 DNA长度多态性,三、亲子鉴定的原理 人类的遗传性状根据受基因控制的程度可分为两类 1、受单一基因座的等位基因控制，与环境无关的单纯遗传特征，如血型、DNA多态性、耳垢型、味觉能力等 2、受多基因座共同控制，同时还受环境、营养状态、疾病等非遗传因素影响的复杂遗传特征，如身体的形态、容貌、肤色、皮肤纹理等。 单基因遗传特征分析是亲子鉴定最可靠

4、、最基本和最常用的方法。,亲代与子代基因型关系 亲代基因型组合 子代基因型 亲代基因型组合 子代基因型 aaXaa aa bbXbb bb aaXbb ab bbXab bb，ab aaXab aa，ab abXab aa，bb，ab 注：a、b代表某基因位点上不同的等位基因,决定某一性状的基因在亲代与子代之间传递的规律： 1、孩子的一对等位基因必定是一个来自父亲，一个来自母亲； 2、孩子不可能带有双亲均没有的等位基因； 3、除非父母双方均有同一基因，否则子女不会是纯合子； 4、父母之一若是纯合子，则子女必得其一。,鉴定亲子关系的基本原则： 1、在肯定某个基因必须来自生父，而假设父亲并不具有这

5、个基因的情况下，可以排除亲子关系。 2、在肯定某个基因必须来自生父，而假设父亲具有这个基因的情况下，不能排除其亲子关系。,根据遗传标记判定父权 血型组合 生父 可以排 不能排 母亲 孩子 基因 除父权 除父权 aaXaa a bb aa ab aaXab b aa ab bb abXaa a bb aa ab bbXbb b aa ab bb bbXab a bb ab aa abXbb b aa ab bb abXab a、b aa ab bb,亲子鉴定应具备的条件 1、鉴定人的资格：鉴定人必须获得相应的资格，具备相应的遗传学和分子生物学等学科的知识，熟练掌握相应的检验技术，由具有一定工作经

6、验的专业人员对检测结果进行解释和判断，作出相应的结论。 2、鉴定机构的条件：鉴定机构必须获得相关部门的批准，具有标准化的实验方法和可靠的实验室质量控制体系。 3、被鉴定人的要求：成年被鉴定人应自愿接受鉴定，14岁以下的应征得其监护人的同意。,第二节 亲子鉴定常用的遗传标记 一、基因产物水平的遗传标记 适用于亲子鉴定的血液遗传标记，一般应具备以下条件： 1、表现为简单的遗传性状，其遗传方式经家系调查已明确 2、具有遗传多态性，基因频率分布较均匀，父权排除率高。 3、在相应地区、民族中的群体遗传数据已建立。 4、血型个体发生早，不易受年龄、疾病及其他因素影响。 5、检验方法操作简单，重复性好，结果

7、明确可靠。,（一）红细胞型 1、ABO血型 已知抗体 标准红细胞 分型 抗A 抗B A型 B型 被 + 被 + A 检 + 检 + B 红 血 细 + + 清 AB 胞 + + O ABO血型抗原可以以水溶性糖蛋白的形式存在于人的血清、精液、唾液等体液与分泌液中。因此，也可以通过上述样品的检测判定ABO血型,2、MN血型 MN血型有M型、N型和MN血型3种表型，MN血型基因座位于第4号染色体上，M、N两个等位基因为共显性基因。 MN血型的M、N两种抗原，以糖蛋白的形式存在于红细胞膜表面上。用已知抗-M、抗-N抗体检测未知的红细胞抗原可鉴定MN血型。,3、Rh血型 5种常见抗原D、C、c、E、e

8、构成18种表型。其中RhD抗原具有很强的免疫原性，在输血、新生儿溶血和母儿妊娠不合中具有重要的意义，因此临床上根据RhD抗原的有无分为RhD（+）和RhD（）两种型。Rh血型由位于第1号染色体上的两个高度同原的RhD基因和RhCE基因共同控制，分别编码RhD以及RhCcEe蛋白。 Rh血型抗原为膜内镶嵌蛋白，相应的Rh抗体多为不完全抗体。因此，常用抗人球蛋白实验鉴定Rh血型。,红细胞酶型 红细胞酶型是红细胞多态性同工酶个体间的遗传差异。 亲子鉴定常用的红细胞酶型有：红细胞酸性磷酸酶（EAP），酯酶D（ESD），葡糖磷酸变位酶1（PGM1），乙二醛酶（GLOI）和谷丙转氨酶（GPT）等。,亲子鉴

9、定常用的红细胞酶型 血型系统 生理功能 染色体 等位 表型 定位 基因 EAP 正磷酸单酯+水 2 EAPa A型 EAP BA型 磷酸+醇 EAPb B型 酯酶D 酯+水 13 ESD1 1型 （ESD）型 ESD ESD2 1-2型 脂肪酸+醇 2型 葡糖磷酸变 葡糖-1-磷酸 1 PGM11+ 1+，2-1+ 位酶 PSM1 PGM11- 1+1-，2-1- PGM12+ 1- ，2+ （PGM1亚型）葡糖-6-磷酸 PGM12- 2+1- ，2- 乙二醛酶 甲基乙二醛 6 GLO1 1型 （GLO） GLO GLO2 2-1型 S-乳酸谷胱甘肽 2型 谷丙转氨酶 丙氨酸+丙酮酸 16

10、GPT1 1型 GPT GPT2 2-1型 （GPT型） -酮戊二酸+谷氨酸 2型,小结：红细胞酶型应用电泳分离结合特异性酶组织化学染色的酶谱技术分型，即根据酶蛋白分子的大小和所带电荷量的不同，通过电泳使之分离，利用酶活化催化底物反应显带，并根据电泳谱带的位置，谱带数目、和谱带强弱进行判型。常用电泳分离方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术。,血清蛋白型 是由等位基因决定的人血清中同一种蛋白质的个体差异，表现为氨基酸排列顺序的差别，导致蛋白质的一级和二级结构的不同。 亲子鉴定常用的血清型系统有：结合珠蛋白（HP）、维生素D结合蛋白（Gc亚型）1-抗胰蛋白酶（PiM亚型）、转铁蛋白（T

11、fC亚型）、间-胰蛋白酶抑制剂（ITIH1型）、补体成分和同种异型遗传标记等,亲子鉴定常用的血清型 血型系统 生理功能 染色体 基因 表型 结合珠蛋白 HP蛋白与Hb结合成 16 Hp1 1型 （HP）型 复合物，使Hb中的 Hp2 2-1型 铁得以贮存和再利用 2型 维生素D结 结合和转运维生素D 4 Gc1f 1F，2-1F 合蛋白（G 及其代谢产物 Gc1s 1S，1F1S C亚型） Gc2 2，2-1S 转铁蛋白 参与铁的吸收与转运， 3 TfC1 C1 （TfC亚型） 并与锌的吸收和转运 TfC2 C2 有关 C1C2 1-抗胰蛋 维持蛋白酶与蛋白酶 14 PiM1 M1，M2 白酶

12、（PiM 抑制物之间的平衡， PiM2 M1M2 亚型） 保护组织免受蛋白水解 PiM3 M1M3 酶的分解 M2M3 间-胰蛋白 抑制多种丝氨酸蛋白水 3 ITIH11 1型，2-1型 酶抑制剂（I 解酶活性 ITIH12 2型，3-2型 TIH1型） ITIH13 3型,白细胞型 白细胞型主要是指人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）又称为移植抗原或组织相溶性抗原系统，是迄今发现的最复杂的人类遗传标记。 人类HLA 系统受控于第6号染色体短臂上的HLA区域的多个基因座的复等位基因。 HLA-： HLA-A、 B、C、E、F、G、H、J、K HLA HLA-

13、：DR、DQ、DP 特性：是位于同一条染色体上的，不同基因座的基因紧密连锁，构成单倍型遗传。 HLA抗原分型主要应用微量淋巴细胞毒试验和混合淋巴细胞培养两种方法，前者用于检测HLA-A，B，C，DR，DQ基因座的抗原，后者用于检测HLA-DP基因座的抗原。,二、DNA水平的遗传标记 一、DNA的结构与功能 磷酸 DNA 核苷酸 脱氧核糖 腺嘌呤（A） （4种） 碱基 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） DNA是生物的遗传物质，其基本结构是4种脱氧核糖核酸（核苷酸）通过磷酸二酯键聚合而成的多核苷酸链。 细胞核的DNA分子是由两条反向平行排列的多核苷酸链，以碱基配对的原则（A和T，G和C）

14、通过氢键彼此相连，并围绕同一中心轴盘旋形成双螺旋结构。 生物的遗传信息表现为DNA中核苷酸的排列顺序，并以密码子的形式编码在DNA分子上 DNA的半保留复制 在细胞生命过程中，DNA的两条多核苷酸链中，一条链作为模版，将遗传信息转录给Mrna，Mrna再将信息翻译成蛋白质，决定蛋白质的特异性。,DNA多态性的分子学基础 DNA多态性是指DNA区域中等位基因或片段存在两种或两种以上的 形式，其本质是生物体在进化过程中核苷酸排列顺序改变的结果。 长度多态性 DNA多态性 序列多态性 1、长度多态性：是指两条同源染色体上，同源片段的核苷酸排列 数量存在的个体差异。,重复序列：以多拷贝形式存在的DNA

15、序列称为重复序列，大多存在于基因内非编码区或基因附近。 散在重复序列：单拷贝DNA序列以其单体形式散在分布 于整 个基因组中称为散在重复序列。由于其分布间隔片段大小不 可分为短片段型和长片段型。 串联重复序列：具有特定的重复单位，各重复单位头尾相连 形成的重复序列。又称卫星DNA。 大卫星 卫星DNA 中卫星 小卫星 微卫星 倒位重复序列：重复单位是互补序列，并在同一条DNA链上 呈反向排列的重复序列。 有间隔重复序列 分类 无间隔重复序列,2、序列多态性： DNA序列多态性指在两条同源染色体上，同源DNA序列长度相等，但个别核苷酸存在的个体差异。单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，称为

16、单核苷酸多态性，它是人类可遗传的变异中最常见的一种。由碱基的替代、插入或缺失所致。,SNP用做遗传标记具有以下优点： 1、SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群 中其等位基因频率都可估计； 2、它在基因组中的分布较微卫星标记广泛的多； 3、与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳 定的，尤其是处于编码区的SPN； 4、部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物 蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们可能 就是疾病遗传机制的侯选改变位点。 5、易于进行自动化分析，缩短了研究时间。,DNA多态性的检测技术 DNA指纹技术 分 聚合酶链式反应 类 DNA芯片技术,一、DNA指纹技术 DNA指纹

17、（DNA fingerprint）：是指将人类基因组DNA用限制性内切酶消化后，经电泳分离、萨森印记转移，然后用已知序列小卫星DNA探针根据碱基互补原则与未知基因组DNA杂交，所显示出的由一系列不等距离、相互间隔的多条电泳谱带组成的高度多态性图谱。 图谱中的每一条谱带代表一个特定长度的DNA片段，不同个体之间的差异在图谱中主要表现为谱带位置、数目、密度强弱的差异。 DNA指纹的实质是基因组DNA的限制性片段长度多态性，它的个体差异性取决于所用限制酶的识别序列特异性和探针的特异性。,1、DNA指纹的基本操作过程 1）DNA的提取：提取原则是尽可能的保持DNA分子的完整性，尽可能的除去检材中的蛋白

18、质、多糖、脂类等成分。 2）限制酶消化：这种由于DNA限制酶识别的序列核苷酸结构发生改变，导致酶切位点的产生、消失、或移位，酶切所产生的限制性片段数目和长度改变所呈现的DNA多态现象称为限制性片段长度多态性。 3）电泳分离：利用电泳技术可将酶切片段按分子量从大到小分离。 4）萨森印迹转移：酶解DNA片段经电泳展开在凝胶的不同位置上，由于凝胶介质机械强度低，无法承受以后的操作，故将已分离的DNA片段从凝胶原位转移结合在一张固相滤膜上，这个过程称为萨森印迹转移。,5）分子杂交：是用特异性探针与待侧DNA多态片段在复性条件下形成稳定异源DNA双链的过程。 DNA探针：是指示踪物标记的（同位素或非同位

19、素），能与互补靶核酸序列退火杂交的已知核苷酸片段。 分类 多位点探针：低强度杂交条件下可同时检测多 个VNTR 位点的探针，得到的DNA图谱为DNA指纹。 单位点探针：高强度杂交条件下只检测单个 VNTR多态 片段的探针，得到的DNA图谱为DNA纹印。 6）指纹图显示：同位素标记探针后，利用同位素的放射线在X线片上的 成影作用检测杂交信号，称为放射自显影。,（2）DNA指纹的基本特征 1）体细胞稳定性：同一个体的血液、唾液、精液以及组织器官DNA指纹图是一致的，并且对于同一个健康人来说是终身不变的，这是法医学应用的基本前提。 2）个体高度特异性：不同个体DNA分子水平上遗传本质的差异，决定了同

20、一种限制酶消化基因组DNA，某一个体与另一个体的等位基因片段在数量和长度上是不可能相同的，从而产生具有个体特异性的DNA指纹图。 3）按孟德尔遗传规律遗传：子代DNA指纹图中所有等位基因带都可以在双亲的指纹图中找到，片段的遗传符合孟德尔遗传规律。,2、聚合酶链式反应（PCR） ( 1) 基本原理：PCR技术的基本原理是在耐热DNA聚合酶作用下，以一对特异性序列DNA短片段作为引物，利用加热和冷却交替的循环程序，有选择性的放大基因组内某一小区段。 PCR的循环过程 变性：通过加热使氢键断裂，形成两条单链DNA 退火：温度下降，人工合成的寡核苷酸引物，依碱基互补的 原则，与所要扩增的靶DNA的双侧

21、翼结合。 延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸底物及Mg2+存在 的条件下聚合酶催化以引物为起点的5端向3端的 DNA链延伸反应。,（2）反应体系 1）模板DNA：模板DNA是PCR的起使底物，对于PCR产物的特异性，产量等有重要影响。 2）引物：是指DNA聚合酶启动DNA合成时必须的一段短的寡核苷酸。 引物的特异性要好 PCR引物设计原则 引物的长度要合适 引物的碱基组成分布尽可能随机 引物自身不应有互补序列，防止叠成发夹 3）TaqDNA聚合酶：特点是对合成DNA具有较高的最适温度。TaqDNA聚合酶具有5到3催化活性，可依碱基互补原则，催化引物按5到3方向合成DNA链。 4）DNTP

22、：DATP、DGTP、DTTP、DCTP，浓度为50-200umol/L。 5）反应缓冲系统：标准PCR缓冲液中含有50mmolKCL、10mmolTris-HCL、1.5mmolMgCL2和100ug/ml白明胶,+,（3）反应参数：正确选择变性、退火和延伸的温度、时间及循环次数等参数是保证PCR成功的关键 1）适宜的变性条件是95/30s 2）退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、长度、浓度与模板DNA的匹配程度。退火时间是30s，足以使引物与模板DNA之间完全结合。 3）延伸温度通常在72-75之间，此时Taq聚合酶具有高度活性。PCR延伸时间取决于目的片段的长度和浓度。 4）

23、循环次数一般25-30次比较合适。循环次数过多，易引起非特异性产物量的增加。,扩增产物分析： DNA分型技术分类： 可变数目串联单位序列 AMP-ELP技术：扩增片段长度多态性 （VNTRS） 银染检测 短串联重复序列 多色荧光标 （STR） 记染色 PCR-ASO技术：将PCR扩增产物变性后，通过斑点印迹使解链的扩增 产物固定在尼龙膜上，再用等位基因特异性寡核苷酸探针，分别与尼 龙膜上的PCR扩增产物杂交，然后依据探针标记进行显谱。 AS-PCR技术：引物3端第一个碱基分别与等位基因的特异性碱基相匹 配，通过扩增产物长度的分析，可简单的进行等位基因分型。 PCR-SSP技术：通过扩增产物是有

24、无可简单的进行特异性等位基因。 PCR-RFLP技术：选择能够识别靶DNA序列中特定碱基序列的限制性 内切酶消化PCR扩增产物，消化后DNA片段的数目和长度不同，根据 电泳谱带的位置和数目可判定基因型。 MVR-PCR技术：即小卫星变异作图。 DNA序列测定法：耐热聚合酶双脱氧核苷酸末端终止法,DNA芯片技术 1、定义：是指同时处理分析大量DNA片段的技术，可广泛应用于基因诊断、基因制图、基因表达和DNA序列分析等领域。 2、基本原理：先在载体上固定一系列寡核苷酸探针，再与靶DNA扩增产物作杂交，或将不同的靶DNA分子固定在载体面上，再与不同的探针杂交。杂交信号的检测是根据杂交分子与未杂交分子

25、所发出的不同波长的光实现的，不同区域的荧光信号在芯片上组成荧光分布的谱型可被激光共聚焦显微镜激发和检测，经电脑应用特制的软件处理可得出DNA的序列及其变化情况。,第三节 亲子鉴定相关的统计参数 一、父权排除概率：是指通过某一个遗传标记系统的检测，将不是生父的被控父亲排除的概率即在所有非父被控为生父的男子中，用遗传标记否定父权有多大的可能性。 各个遗传标记系统非父排除概率的大小取决于该系统的遗传方式、等位基因数目以及各等位基因在群体中的频率分布。,（一）常染色体遗传标记系统 1.一个显性基因和一个隐性基因决定的遗传标记系统 （如P血型、分泌型） EPP=pq4 2.两个共显性等位基因决定的遗传标

26、记系统（如MN血型、Hp血型、ESD型等） EPP=pq（1-pq） 3.两个显性基因和1个隐性基因决定的遗传标记系统（如ABO）EPP=p（1-p）4+q（1-q）4+pqr2（p+q）+2pqr2 4.3个共显性等位基因决定的遗传标记系统（Gc、Tfc、PiM等）EPP=（p2+q2+r2）2-（p5+q5+r5）+6pqr+4pqr （p2+q2+r2） 5.多个共显性等位基因决定的遗传标记系统（如STR） n n-1 n EPP=Pi（1-pi）2（1-pi+pi2）+ pipj（1-pi-pj）2 i=1 i=1 j=i=1,（二）性染色体遗传标记系统 1.Y染色体遗传标记系统 n

27、n-1 EPP= Pi（1-pi）=1- Pi2 i=1 i=1 2、X染色体遗传标记系统 n n-1 n EPP=1- Pi2+ Pi4- （Pi2）2 i=1 i=1 i=1 3、积累非父权排除概率 CEE=1-（1-P1）（1-P2）（1-P3）（1-Pk） 上式显示，检测的遗传标记系统越多，累积非父排除率越高，排除非父的机会亦越高。为了最大限度排除非父，选择排除概率高的遗传标记系统和选用更多的遗传标记是十分必要的。,父权指数和父权相对机会 （一）父权指数 1、概念：父权指数（PI）又称亲子关系指数，是假设父提供父基因成为孩子生父的可能性与随机男子提供生父基因成为孩子生父可能性的比值，表

28、示假设父为孩子生父的机会比随机男子为孩子生父的机会大多少倍。 X PI= Y X=母亲提供生母基因概率（f）X假设父提供生父基因概率（C） Y=母亲提供生母基因概率（f）X随机男子提供生父基因概率（p） 基因频率：是指在一个两倍体的特定基因座位上某一个等位基因占该基因座上等位基因总数的比率。 基因型频率：是指在群体中某特定基因型个体的数目占被调查个体总数的比率。,父权指数的计算 一、三联体亲子鉴定 1、母子关系肯定的亲子鉴定 1）确定母亲遗传生母基因的机会（f） 2）确定随机男子提供生父基因的机会（g），一般使用相应的群体基因频率 3）确定假设父提供父基因的机会（c） 4）计算随机男子成为生父

29、的机会，Y=f X g 5）计算假设父成为生父的机会，X=f X c 6）计算父权指数,PI值计算例 案 表型 必须基因 f Y X PI 例 孩子母亲被控父 母亲 生父 1、B A AB O B 1 1X0.2556 1X0.5 1.96 2、AB AB B A B 0.5 0.5X0.2556 0.5X0.596 1.28 B A 0.5 +0.5X0.2092 +0.5X0 3、B B AB B B或O 0.404 0.596X0.2556 0.596X0.5 0.87 0.596X0.5352 0.596X0 +0.404X0.2556 +0.404X0.5 O B 0.596 0.5

30、748 0.5 4、B O B O B 1 1X0.2556 1X0.569 0.23,父母均怀疑的亲子鉴定 单亲亲子鉴定,父权相对机会 PI X RCP= = X100% PI+1 X+Y 其中X/X+Y 又称为父权概率或父权肯定几率（W）,第四节 亲子鉴定结果的评估 一、排除亲子关系 （一）排除父权的类型 1、直接排除：有争议的可疑父亲与孩子中至少有一个为杂合子时，若他们之间的遗传标记违反遗传规律，排除亲子关系则为直接排除。 直接排除父权的案例 母亲 孩子 可疑父亲 案例1 A型 AB型 A型 案例2 A型 O型 AB型,2、间接排除 有争议的可疑父亲和孩子由表型推测均为纯合子时，如他们之

31、间的遗传标记违反遗传规律，排除亲子关系则为间接排除。 间接排除父权的案例 母亲 孩子 可疑父亲 案例1 Hp2-1型 Hp2型 Hp1型 案例2 MN型 M型 N型,（二）排除父权的原则 1、只有一个遗传标记排除（无论是血型遗传标记还是单基因位点DNA遗传标记）时，不能轻易作出否定结论，必须加测其他系统。 2、有两个遗传标记排除时，要根据具体情况分析。 如ABO、HLA违反遗传规律，则可做出排除结论 一个基因产物水平遗传标记直接排除，一个DNA遗传标记排除，且可疑父亲与孩子均为杂合子，则可否定可疑父为生父 两个DNA遗传标记排除需慎重对待，宜加测遗传标记后再具体分析，加测标记数目要考虑CCE值达到0.9997以上，结论较为稳妥。 3、有三个及以上遗传标记排除，一般可作出排除亲子关系的结论。,（三）可能错误否定父权的情况 1、遗传变异：有沉默基因、替代等位基因、基因缺失、基因互换、基因突变、弱抗原、嵌合体抗原、生理与病理变异等。 2、检验过程：,二、肯定亲子关系 1、