蛋白质等电聚焦

1、第七章蛋白质的等电聚焦，等电聚焦原理，等电聚焦技术，等电聚焦的优缺点，固相酸碱度梯度等电聚焦技术的进展，液体介质、凝胶介质等电聚焦，等电聚焦，简称IEF或EF，是20世纪60年代中期出现的一种分离不同等电点蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01个单位，特别适合分离分子量相近但等电点不同的蛋白质组分。等电聚焦具有分辨率高、操作简单、重复性好等优点，已广泛应用于生物化学、分子生物学、遗传学、分类学和临床医学研究。然而，等电聚焦的缺点是需要无盐溶液，并且一些蛋白质在无盐溶液中溶解度低，这可能导致沉淀。此外，样品中的所有成分都集中在它们的等电点上，这不适用于一些在等电点不溶或变性的蛋白质。等电聚焦

2、原理等电聚焦是根据蛋白质分子或其他两性分子不同的静电荷或等电点来分离它们的技术。在等电聚焦中，蛋白质分子在由含有载体的两性电解质形成的连续且稳定的线性酸碱度梯度中电泳。载体两性电解质为脂肪族聚氨基多羧酸，在电场中形成连续的酸碱度梯度，正极为极酸性，负极为碱性。蛋白质分子在偏离其等电点的酸碱度条件下带电，因此它们可以在电场中移动；当蛋白质迁移到等电点时，其静电荷数为零，在电场中不移动时，会产生聚焦现象，形成蛋白质带，可以分离不同等电点的蛋白质。目前，蛋白质研究中使用的等电聚焦方法有很多种，根据IEF使用的支持介质类型，基本上可以分为两类：一类是液体介质中的等电聚焦。另一种是凝胶介质中的等电聚焦，

3、即等电聚焦凝胶电泳。我们将在下面分别介绍这两个类别。2.1液体介质中垂直柱状蔗糖密度梯度等电聚焦是瑞典LKB公司用于制备和分析的早期等电聚焦方法。载体两性电解质在蔗糖密度梯度柱中形成酸碱度梯度，样品根据其等电点进行分离。使用这种方法需要很长时间。它们中的一些也使用液体介质来制备等电聚焦。但它是水平圆柱形的，分成20个空腔。这些室由单丝聚酯筛网制成的薄膜隔开。据说该方法所需的分离时间仅为4小时左右，样品装载量可达4克.2.1.1设备和试剂的制备1聚焦柱中有成品出售，分为110毫升和440毫升，2个电源，0伏，1200伏，可调20瓦DC稳压电源，3个载体双极电解质，以25毫升瓶装出售，浓度为40或

4、20(瓦/伏)，酸碱度范围为2.511，其他酸碱度范围可根据实验条件购买。4蔗糖(分析纯)，5。电极溶液的制备见下表(表1、表2)，正电极缓冲溶液的制备见表1，负电极缓冲溶液的制备见表2。该制剂剂量为最大剂量，一般为1/5。440ml聚焦柱模型的公式在括号中。重、轻液体的制备和混合重、轻液体的制备制备方法见下表3。此表为梯度混合器的剂量。如果使用手动混合规则，应相应增加20。如果条件允许，可以使用混合重质和轻质液体的梯度混合器进行柱装载。手动混合方法如下：取24个试管(440毫升聚焦柱46个试管)，按表4加入重、轻液体，充分混合。表4重、轻液体混合配方，2.1.2操作方法1确定电极的极性。如果

5、酸碱度梯度范围低于6，聚焦柱底部的电极为正电极。如果酸碱度梯度范围大于6，柱底为负电极。2.柱负载根据电极的极性和电极溶液的要求而定。注入载体溶液4。加入轻混合溶液5。连接用于电泳的冷凝水管道6。7.收集样品8。测量每个试管的酸碱度和蛋白质含量。将相同蛋白质的试管与相似的pH 9混合。用葡聚糖凝胶G25(或G50)从载体上分离每个分离的样品组分。2.凝胶介质在电场的作用下，在凝胶中沿电场方向产生一个酸碱度梯度。当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都会迁移到与其等电点一致的酸碱度，不同等电点的各种蛋白质最终会迁移到凝胶中相应的酸碱度，达到分离的目的。目前，聚丙烯酰胺凝胶电泳被广泛使用。向

6、凝胶中加入两性电解质溶液(pH9-3)，施加电场后，凝胶中形成稳定的酸碱度梯度。然后加入样品，继续电泳。凝胶染色显示，样品根据其pI值沿酸碱度梯度分布。高酸碱度，在等电聚焦电泳过程中，低酸碱度，()，()，高酸碱度，等电聚焦电泳后低酸碱度。仪器：微电泳系统、电源、注射器、固定和染色容器、GE Healthcare等电聚焦电泳系统、试剂：丙烯酰胺、双丙烯酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸铵、TEMED、TritonX100、2巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇储存溶液：1)30(w/v)丙烯酰胺和1(w/v)双丙烯酰胺；2)20T riton X100；3)10

7、%三氯乙酸；4)1三氯乙酸；5)1溴酚蓝；6)考马斯亮蓝染色液；7)考马斯亮蓝脱色液，2.2.2载体的选择两性电解质是等电点相近、分子量为600900道尔顿的聚氨基多羟基两性化合物的混合物，其选择应满足以下条件：溶解性好。紫外吸收低，无荧光。等电点处必须有足够的缓冲容量。等电点必须有足够高的电导。分子量应该很小。6.化学成分应与分离的物质不同，以免干扰测定。7.无毒，无生物效应。8.它不应与分离的物质反应或使其变性。以下是用于制备不同酸碱度范围的等电聚焦凝胶的载体两性电解质的配方(表5)。2.2.3操作方法聚焦过程需要凝胶制备、电泳和检测。1.8cm7cm0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝

8、胶的配方中填充有胶水。其他酸碱度范围内的等电聚焦可参考表5进行制定。水：5.4毫升；储存溶液1): 2.0毫升；载体两性电解质溶液的ph值为3.5-1048微升；载体两性电解质溶液的ph值为4-6240微升；超纯尿素6.0g10胺过硫酸盐25ul；TEMED:20ul，灌胶步骤：1)。组装灌胶装置；2)。将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混合均匀，避免剧烈摇动，并轻微加热尿素使其溶解更快(带手套，丙烯酰胺有毒)；3)。加入过硫酸铵和TEMED，轻轻混合(开始聚合，快速操作)；4)。将上述混合溶液倒入点胶机(尽量避免气泡)；将梳子插入胶水中(不要产生气泡)；6)。聚合约1小时；7)聚合完成后，

9、小心取下梳子；8)将凝胶与冷却装置连接，并将其插入电动游泳池。在装载蛋白质样品之前，最好将阳极电极溶液注入上罐，以确定是否有任何泄漏。注：1)装载前，空样品底部未聚合的丙烯酰胺将被冲走，否则在电泳过程中会发生聚合；目前，已有商业化的等电聚焦凝胶，但仅限于水平平板电泳系统(如PharmmaciaLKB、Hoefer)。2.不同厚度和不同梳孔数的凝胶样品制备和加载将有不同的加载量。例如，厚度为0.75毫米、有15个孔的凝胶，每个孔的最大装载量约为15ul。3。电泳步骤： 1)。将蛋白质样品与相同体积的两种装载缓冲液混合，在10000克离心5分钟，以除去蛋白质沉淀；2)用微型注射器将蛋白质样品添加到

10、装载样品的空底部4)连接电极5)在150伏的恒定电压下电泳30分钟，6)在200伏的恒定电压下电泳2.5小时，并将开始时的电流控制在10mA左右。聚焦时，电流会减小，电泳时电泳室内的温度会上升到4050。4.电泳聚焦后处理1)。测量酸碱度梯度将凝胶条切成0.5厘米或1厘米的小片。将每小片凝胶浸泡在1毫升10毫米KCl水中30分钟，以测量KCl溶液的酸碱度。2)。固定凝胶。将凝胶浸泡在10%三氯乙酸中10分钟，然后将其换成1%三氯乙酸溶液，继续浸泡至少2小时。除去载体两性电解质3)。用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，然后脱色，制成干凝胶，2.2.4天然等电聚焦电泳的修改方案如果要进行天然等电聚焦电泳，

11、需要做一些修改。1.在凝胶过程中制备的凝胶中不需要尿素。2.装载缓冲液(2)5ml: 1.8ml水，200ul载体两性电解质(与凝胶成分相同)装载时，将样品等体积混合，在10000g离心5秒，然后装载样品。3.室温电泳，连接电极，在200伏下电泳1.5小时，然后在400伏下恒压电泳1.5小时。等电聚焦的注意事项等电聚焦后，可使用染色细线(0.1毫米)来标记染料前沿的位置。为了获得最佳的重复性，通常不需要更换载体。两性电解质的品牌酸碱度梯度范围为2，是一个更好的选择。几种不同酸碱度梯度的电泳优于只有一种较长凝胶的电泳。非平衡酸碱度梯度电泳可以在高酸碱度范围内聚焦蛋白质，但不能用于测定蛋白质的等电

12、点。6.应该注意的是，变性蛋白质的等电点可能不同于天然蛋白质的等电点。7.如果蛋白质溶液含有SDS，尿素可以添加到最终浓度为8M。在高浓度尿素下，SDS与蛋白质的相互作用极小。2将riton X100添加到变性溶液中，以确保蛋白质(尤其是膜蛋白)的完全溶解。9.超薄凝胶(50-500微米)优于普通标准等电聚焦。10.琼脂糖凝胶或琼脂糖丙烯酰胺凝胶更适合高分子量蛋白质。第四次等电聚焦的优点和缺点优点：可以分离分辨率很高的非常薄的样品，并且可以用于测定蛋白质或多肽的等电点，具有良好的重现性。缺点：需要无盐溶液，但是一些蛋白质在无盐溶液中溶解度低，这可能导致沉淀。样品中的所有成分都集中在它们的等电点

13、上，这不适用于一些在等电点不溶或变性的蛋白质。一种广泛使用的等电聚焦电泳技术固相酸碱度梯度等电聚焦5.1原理固定酸碱度梯度等电聚焦是20世纪80年代建立的一种新的等电聚焦技术。使用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物。它们与丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有相似的聚合行为。瑞典LKB公司(现为通用电气医疗集团，安布罗西亚公司)的商品名是伊姆丁。瑞士弗卢卡公司的商品名是pI Select。其结构式为：O H CH C N R (R代表羧基或叔氨基)固定分子的一端为双键，在聚合过程中可通过共价键嵌入聚丙烯酰胺介质中。因此，即使在电场中，它也是一个“固相”。在分子的另一端是缓冲基团r，它是弱酸

14、或弱碱，可以在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系。通过使用缓冲体系滴定终点附近的酸碱度范围，可以形成近似线性的酸碱度梯度。固相酸碱度梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更高的分辨率和更大的样品负载，其分辨率可达0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法之一。，5.2仪器和试剂仪器：Pharmacia公司的IPPHOR系统，试剂：丙烯酰胺双丙烯酰胺固定剂二过硫酸铵TEMED储存溶液：1)。将14.55克丙烯酰胺和0.45克氮，氮双甲基丙烯酰胺溶于40毫升双蒸水中，溶解后过滤，定容至50毫升，可在4下储存2周。2)。在使用之前，在室温下，在48下储存半小时，保持溶液平衡。固定化电解质可分为酸性和碱性，分别

15、含有弱羧基和氨基。商品化的固定化电解质有6-7种，但在实验室可以合成17种不同pK值的丙烯酰胺衍生物，利用不同pK固定化电解质的组合可以制备不同酸碱度范围的凝胶。5.3操作方法固相酸碱度梯度等电聚焦需要较高的电压，所以一般采用水平电泳。聚焦过程还需要三个步骤：制胶、电泳和检测。1.凝胶填充：酸性固定化电解质通常用作重液体，碱性固定化电解质用作轻液体。下表显示了凝胶配方、表6固相(solid pHase)酸碱度梯度凝胶配方，不同酸碱度梯度范围内添加的固定化电解质的量不同，见下表7:(仅列出一部分供参考)，以及凝胶填充步骤：1)。组装凝胶填充装置2)。添加7.5毫升(取决于凝胶大小。3)向梯度混合

16、器的混合室中注入相同体积的重液体，将相同尺寸的搅拌器放入两个混合室中，并将补偿杆放入储液室中。此时，两个腔室中的液位应该是水平的。4)将梯度混合器放在磁力搅拌器上，将流出管插入灌胶模具的中心。向两个腔中加入TEMED，然后加入过硫酸铵，打开流出管的夹具。当酸液流到流出管的一半时，两个腔之间的阀门打开，两个腔中的液位同时下降。在混合腔中混合均匀后，将其缓慢注入垂直放置的模具中。6)灌注后，室温放置5-20分钟(用异丙醇密封)，在50烘箱中聚合。7)聚合需要大约1小时。完成后，取出凝胶并用正极和负极标记。称取凝胶，将其放入双蒸水(610分钟或31小时)中，在室温下摇动60次/分钟，以洗去催化剂和未聚合的单体。9)。用冷空气吹胶，直到洗胶前的重量差小于1。灌胶时应注意以下问题：1)稳定液相梯度2)正确测量缓冲液的体积并滴定不动的ne 3)梯度混合器的位置和搅拌速度4)填充速度5)稳定时间2。固相酸碱度梯度等电聚焦样品制备和进样与载体两性电解质等电聚焦基本相同。固相酸碱度梯度等电聚焦通常是水平电泳，垂直电泳没有取样孔。理论上，在凝胶的任何位置添加样品都可以获得相同的结果，但实际上，应该避免在电极附近或等电点附近添加样品。电泳：以Pharmacia的IPGPhor系统为例1)打开循环水浴，设定冷却温度为10。2)将固相酸碱度梯度凝胶涂在冷却板上。3