《层析分离技术导论》PPT课件

1、列色谱分析法分离技术、列色谱分析法分离的基本概念及其特征列色谱分析法分离的分类和基本原理列色谱分析法的应用、目录、列色谱分析法分离是一个物理分离过程，利用多组分混合物中各组分的物理化学性质的差异，使各组分在不同程度上分布在两个相(固定相和流动相)。 多成分混合物与流动相一起移动时，由于各成分的物理化学性质的不同，在固定相和流动相之间经过多次分配(吸附解吸再吸附再解吸)以不同的速度移动，达到分离的目的。 1 .列色谱分析法分离的基本概念：分离效率高的应用范围广、灵敏度高的上线了检验迅速分离过程的自动化操作、2 .列色谱分析法分离的特征； 1 .分离反应历程分离柱色谱分析法凝胶过滤柱色谱分析法2

2、.流动相物理形态分离气相柱色谱分析法超临界柱色谱分析法、柱库吉卜赛人分类柱色谱分析法分类，3 .在操作压力下进行低压色谱分离(20 g/d )； 对柱色谱分析法的基本原理进行分类，利用被分离物质中各成分与固定相和流动相的相互作用不同，通过多次相互作用逐渐分离不同成分。 柱色谱分析法的基本原理，1 .吸附色谱法的原理：当混合物与流动相一起通过固定相(吸附剂)时，混合物被固定的相对不同物质的吸附力分离。 传统吸附剂：氧化铝、硅凝胶、活性炭、磷酸钙元素等。 特点：应用最快，价格低，选择性低。 新型吸附色谱法技术：离子交换色谱、亲和色谱分析法、疏水作用色谱分析法、金属螯合色谱分析法等。 柱色谱分析法的

3、基本原理，2 .分配色谱的原理：其固定相与流动相都是液体，其原理与液液萃取相似，并利用混合物中各物质在两液相中的分配系数差异进行分离。 其中，固定相是由固定液和载体结合而成的。 正相色谱分析法：固定相为极性，流动相为非极性反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。 柱色谱分析法的基本原理，3 .凝胶过滤柱色谱分析法原理：根据物质分子大小分离的色谱技术也被称为分子筛色谱。 大分子和小分子在通过柱时通过的路径不同(大分子进入空隙，小分子进入孔内)，因此流出柱的时间不同，得到分离。 其固定相为凝胶，流动相可根据实验需要选择不同的缓冲溶液。 主要用于脱盐、分级分离、分子量测定等。图9-10凝胶过滤色谱分

4、析法的原理、本章的教学要求、基本要求：掌握色谱分析法(色谱分析法)分离法的基本概念和分类，理解常用色谱分析法分离方法的基本原理和应用。 重点：凝胶过滤色谱分析法、离子交换色谱、亲和色谱法、固定金属络离子亲和色谱法。 难点：常用色谱分析法的分类和合理选择。 7.1色谱分析法技术导论、一、色谱分析法分离的基本概念及其特征二、色谱分析法分离的分类三、色谱分析法分离的基本原理四、色谱分析法理论五、色谱分析法过程和仪器设备，一、色谱分析法分离的基本概念及其特征、色谱分析法分离技术自20世纪初开始在生产实践中应用。 1903年，露西亚Tswett在研究植物叶片组成时，以碳酸钙元素为吸附剂，石油精为洗脱剂，

5、将干燥的碳酸钙元素粉末装入细长的玻璃管中，将植物叶片的石油精提取液浇入管内上部的碳酸钙元素后， 提取液中的色素吸附在管内上部的碳酸钙元素上，用纯粹的石油精溶出的该方法将玻璃管称为“柱”，将碳酸钙元素称为“固定相”，将纯粹的石油精称为“流动相”。 因此，色谱分析法分离也称为色谱分析法分离(Chromatographic Resolution，CR )或者色层分离，在本章中统一使用色谱分析法分离这一名称。7.1色谱分析法技术的序论1、色谱分析法分离的基本概念及其特征、色谱分析法分离是一个物理分离过程，利用多组分混合物中各组分的物理化学性质的差异，使各组分在不同程度上分布在两个相(固定相和流动相)上

6、。 多成分混合物与流动相一起移动时，由于各成分的物理化学性质的不同，在固定相和流动相之间经过多次分配(吸附解吸再吸附再解吸)以不同的速度移动，达到分离的目的。 1 .色谱分析法分离的基本概念：分离效率高的应用范围广、灵敏度高的上线了检验高速分离过程自动化操作，2 .列色谱分析法分离的特点，7.1色谱分析法技术导论2，色谱分析法分离的分类1 .分离反应历程别吸附色谱法，分配色谱法， 凝胶过滤色谱分析法2 .固定相形状分类柱色谱分析法、纸色谱分析法、薄层色谱法3 .流动相物理形态分类气相色谱分析法、液相色谱分析法、超临界色谱分析法4 .操作压力分类低压色谱法(20 g/d )、传统吸附剂：氧化铝、

7、硅胶、活性炭、磷酸钙等。 特点：应用最快，价格低，选择性低。 新型吸附色谱法技术：离子交换色谱、亲和色谱分析法、疏水作用色谱分析法、金属螯合色谱分析法等。 1、吸附色谱法、7.1色谱分析法技术导论三、色谱分析法分离的基本原理：其固定相与流动相都是液体，其原理与液液萃取相似，并利用混合物中各物质在两液相中的分配系数差异进行分离。 其中，固定相是由固定液和载体结合而成的。 正相色谱分析法：固定相为极性，流动相为非极性反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。 2、分配色谱、7.1色谱分析法技术导论三、色谱分析法分离的基本原理、原理：根据物质分子大小分离的色谱分析法技术又称分子筛色谱分析法。 大分子和

8、小分子在通过柱时通过的路径不同(大分子进入空隙，小分子进入孔内)，因此流出柱的时间不同，得到分离。 其固定相为凝胶，流动相可根据实验需要选择不同的缓冲溶液。 主要用于脱盐、分级分离、分子量测定等。 3 .凝胶过滤色谱分析法，图9-10凝胶过滤色谱分析法原理，7.1色谱分析法技术指针4，色谱分析法理论，1分配系数2色谱分析法曲线3理论塔板数4分离度，1分配系数，色谱过程中某时点，流动相中样品浓度为Cm， 如果固定相中样本的浓度在Cs全层分析过程中Cm和Cs之间存在线性关系，即分配系数k为常数，则将该层分析过程称为线性层分析，如果在Cm和Cs之间不存在线性关系且出现其他函数关系，则将对应的层析分离

9、过程称为非线性层析。 1分配系数是为了更好地描述色谱分析法中Cm和Cs的关系，在吸附色谱法中分离系数在凝胶色谱分析法中诱导分配常数Kd，1分配系数分配系数k类似于分配系数：溶剂萃取中的分配系数K=cs/Cm cs， cm是在溶质为固定相的温度下，溶质浓度低时，k是常数线性色谱分析法，溶质浓度高时，k是溶质浓度的函数非线性色谱分析法。 在层析过程中，分配系数大的成分移动速度慢，分配系数小的成分移动速度快。 因此，分配系数差异大的两种物质在层析过程中容易分离。 为了在吸附层分析过程中更好地记述液相与固相中被分离物质的浓度关系，1分配系数的分离系数大多用吸附等温曲线表示。 a单分子层吸附； b多分子

10、层的吸附； c单分子层和多分子层混合吸附。1分配系数分离系数、分离系数：某瞬间吸附的溶解质量占总量的百分比(表示):=cs/CT=cs/(cscm)01:=0时，该溶解质与固定相不产生吸附作用，或者固定相中没有空位的结合位点=1时，溶质全部吸附于固定相中，并与流动相一起移动对于列色谱分析法的分离中，有效的分离通常要求至少0.8的值。 1分配系数分配常数Kd在凝胶色谱分析法中导入了表示某个溶质分子能够进入凝胶粒子内部的空隙中的百分比的分配常数Kd。 凝胶柱的总体积Vt被分为Vt=V0 Vi Vm V0凝胶粒子间的空隙的总体积(即外水体积)和Vt=V0 Vi Vm V0凝胶粒子间的空隙的总体积(即

11、外水体积)这3个部分，Vi凝胶粒子内部的空隙的总体积(即内水体积)； Vm凝胶粒子沉积基质自身所占的体积。 某溶质分子充满色谱分析法柱的体积(即溶出容积Ve )，Ve=V0 Kd Vi Kd=(Ve-V0)/Vi Ve被测定分子的保持体积(参照色谱分析法曲线) V0，可以使用分子量远远超过凝胶排阻限的有色分子来测定， 此时的保持体积V1是色谱分析法柱的v的Vi可以用能够自由扩散的小分子(例如中性盐)溶液测定，此时的保持体积V2=V0 Vi、1分配系数分配常数Kd、0Kd1是Kd=0时，意味着溶质分子完全排出到凝胶粒子的细孔之外，首先被洗脱。 当Kd=1时，溶质分子完全不被排除，意味着自由进入所

12、有凝胶粒子的细孔，最后洗脱。 实际操作时有时会发生Kd1，暗示了在凝胶的分子筛作用的基础上还有吸附作用。2层析曲线在列层析中，为了表示层析效果，通常采用层析曲线(色谱流出曲线，也称作色谱)。 在图9-3矢量格拉夫模式图、2矢量格拉夫、(1)基线(2)保持值(3)相对保持值(4)区域宽度、2矢量吉卜赛人格拉夫、无样品通过检测器的情况下，检测信号成为基线，在条件稳定时，(1)基线、2层分析曲线的样品中的各成分停留在层分析柱内通常用时间或对应的流动相体积来表示。 1 )时间显示的保持值2 )体积显示的保持值、(2)保持值、2个时钟格拉夫、保持时间(tR ) :成分从试样进入柱后到出现浓度极大值所需的

13、时间(图9-3的OB )； 死区时间(tM ) :固定相和不作用的移动相的保持时间(图9-3中用OA表示)。 调整保留时间(tR ) :扣除死亡时间的保留时间(图9-3的AB )，tR=tR - tM注意：如果固定相一定，在规定的实验条件下，任何物质都有一定的保留时间，这就是色谱分析法分析法的基本残奥表。 (2)保持值1 )用时间表示的保持值、2色谱分析法曲线、保持体积(VR ) :指从试料注入到柱后出现被测定成分浓度的极大值时通过的流动相体积。 VR=F0tR(F0为层析柱出口处的流动相产水量，即体积流动率，单位： ml/min )。 死体积(VM ) :指库塔格拉夫柱内的除填充物固定相以外

14、的空隙体积、库塔格拉夫中的管路和连接点之间的空间及检测器空间的总和。 VM=F0tM调整保留体积(VR ) :减去死体积的保留体积。 虚拟机=虚拟机。 (2)保持值2 )用体积表示的保持值、2色谱分析法曲线意味着成分2和成分1调整保持值的比，无量纲量，即，r21=tR2/tR1=VR2/VR1注意：相对保持值只与柱温度和固定相的性质有关(3) 用于测定色谱格拉夫峰宽的残奥仪的相对保持值r21、2色谱吉卜赛人格拉夫有3种表示方法：1)标准离差：在色谱峰呈现高斯分布时，曲线两侧的拐点间的距离的一半，即峰高0.607倍的峰宽的一半2 )半值如图9-3的GH那样。 注意：由于半峰宽易于测量、使用方便，

15、因此一般用于表示区域宽度。3 )峰值基准宽度Wb :即流出曲线的拐点的切线在基线上的截距如图93中的IJ所示。 与Wb的关系： Wb 4。 (4)区域宽度，3理论塔板数，20世纪50年代，在色谱分析法技术发展初期，Martin等人将色谱分析法分离过程比喻为分析过程，将分析过程中的半经验理论塔板理论用于色谱分析法分析法。 反应不同时刻溶质在柱中的分布及分离度与柱高的关系理论架数的修正计算方法： n=5. 54 (tr/w1/2)2n=16 (tr/WB )2n- -理论架数tR-保留时间W1/2-半峰宽Wb-峰底宽度理论架高： h=l/n 1 决定理论塔板高度的主要原因是，固定相的材质、色谱分析

16、法柱的均匀度、流动相的理化性质流动相的流速等。 由于同一柱对不同物质的柱性能不同，用理论塔板数(n )和理论塔板高度(h )表示柱性能时，应当写明被测物质和断层条件。 4个分离度、Rs=(两个峰值之间的距离)/(平均峰值宽度) Rs代表吉卜赛人格拉夫峰值的分离度Rs1，其中两个峰值完全分离是最佳分离条件。 4分离度、分离度依赖于分离效率和选择性：分离效率依赖于峰值宽度，选择性依赖于两个峰值之间的距离。7.1色谱技术导论5、断层过程和仪器设备、(1)柱(2)平衡(3)上样(loading) (4)清洗(washing )调浆： 50%连续放入混悬剂打开出口阀：色谱分析法剂沉降排除空气检测均匀度、1 .柱、 7.1色谱分析法技术导论5、色谱分析法过程和仪器设备使用与样品相同的缓冲液平衡柱，直至电导率稳定。 缓冲液体系包括缓冲液的种类和浓度、pH及盐浓度。 2、平衡、7.1色谱分析法技术导论5、色谱分析法过程和仪器设备、样品处理：溶解选择适当的缓冲液种类pH值浓度调节样品浓度过滤：不溶物去除流速：样品浓度和吸附速度决定样品量： 80%交换容量，3适量界面激活剂(0.1-0.5% )； 清洗体积：由流出液蛋白质浓度决定(A2800.05 )、4 .清洗(washing )、7.1色谱分析法技术导论5、色谱分析法过程和仪器设备操作方式a .稳态洗脱(stage elutio