实验五 人类染色体标本制备

1、实验五人类染色体标本制备【目的要求】1熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。2初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。3了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。【实验原理】人类间期细胞核中的遗传物质染色质，在细胞进入分裂期时，经逐级螺旋形成染色体。在分裂期的中期，染色体达到最大程度的凝集，表现为短而粗的典型结构。人外周血的有形成分中，只有白细胞有核，而白细胞中只有淋巴细胞(主要是小淋巴细胞)具有潜在的细胞分裂能力。培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素(pha)可使处于g0期、具有潜在分裂能力的淋巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞，并进入旺盛的有丝分裂周期；加入纺锤体抑制剂秋水仙素可使

2、处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期，在收获细胞时，用低渗剂0.075 mol/l kcl对细胞进行低渗处理，可使胞膜胀破，染色体均匀分散；经离心、固定、制片等过程，最终可获得便于观察分析的染色体标本。制备的染色体标本片，不经特殊处理，直接染色，在显微镜下观察识别，并进行核型分析的过程称为染色体非显带核型分析。【实验用品】(一) 材料：人外周静脉血。(二) 器材：吸管、刻度离心管、量筒、5ml注射器、6号针头、台式离心机、试管架、冷藏载玻片（一端磨砂）、铅笔、酒精灯、超净工作台、恒温水浴箱、载玻片、止血带、酒精棉球、显微镜、废液缸。(三)试剂1. rpmi1640培养液 (1) rpmi164

3、0：rpmi1640固体培养基10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中，抽滤除菌。(2) rpmi1640培养液：每100 ml rpmi1640培养液中含rpmi 1640 80 ml、灭活的小牛血清20 ml、pha 50 mg、青霉素(终浓度100 u/ml)、链霉素10000 g (终浓度100 g /ml)，15磅、20min高压灭菌的nahco3调ph至7.27.4，分装20小瓶，每瓶5 ml。(3) 配制方法 配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净，烘干，放入清洁液中浸泡2 d，取出后用自来水冲洗15次，蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗1次，烤干后包装，15磅20 min高压灭菌。新瓶

4、塞等橡胶类制品用水洗刷后，用0.5mol/l naoh煮沸20min，自来水冲洗；用0.5mol/l hcl煮沸20 min，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，在双蒸水中浸泡24h；浸泡后取出晾干，包装后高压灭菌。使用过的橡胶制品用肥皂液洗后，再用自来水，蒸馏水、双蒸水冲洗，晾干包装后高压灭菌。无菌室用紫外灯消毒2 h。进入无菌室前用肥皂彻底洗手，双手在新洁而灭溶液中浸泡20 min，然后穿隔离衣，戴口罩、帽子，进入无菌室操作时，再用75酒精擦手。在无菌室内，将rpmi l640粉剂10.4 g，溶于1000 ml双蒸水中，(rpmi1640粉剂较难溶，可用酒精灯微火稍加热，或通入co2使ph降至6.0

5、左右可溶解)。液体呈透明状说明已完全溶解，倒入细菌滤器中过滤除菌。在无菌室的超净工作台内，取适量已抽滤的rpmi1640加入成比例的灭活小牛血清、pha、青霉素和链霉素，混匀，用经过15磅20 min高压灭菌的5 nahco3调至ph7.2，分装成每瓶5 ml，冰冻保存。已除菌过滤、未分装的rpmi1640也需冷冻保存。2无菌肝素（500 u/ml）：肝素注射液1支2 ml（含12500 u），加23 ml无菌生理盐水混匀（或肝素粉剂，用时配成0.2%肝素液），经8磅15 min高压灭菌，置4冰箱保存备用。3其他试剂：0.01%秋水仙素、0.075 mol/l kcl低渗液、carnoy固定液

6、、10% giemsa染液。【实验操作】(一) 染色体标本制备1.取材培养(1) 采血：用无菌注射器吸取约0.2 ml肝素液，来回抽动针筒，使肝素湿润针筒，戴上针头套；彻底消毒采血处皮肤，抽取静脉血约2 ml，戴上针头套，转动针筒，使肝素与血液混匀，防止血液凝固（采血过程中严格执行无菌操作）。在超净工作台内，去掉针头套，用无菌棉球擦除针头上的血迹；用酒精棉球消毒盛有5 ml培养液的培养瓶瓶塞，并将瓶塞在酒精灯火焰上过一下；在酒精灯火焰旁，将采血的注射器针头经培养瓶皮塞插入培养瓶中，每瓶接种血液约0.3 ml，轻轻摇匀。(2) 培养：培养瓶置37恒温箱中培养，当培养至68 h，取出培养瓶，在超净

7、工作台内，用注射器(5号针头)向培养瓶中加入0.01%秋水仙素1滴，轻轻摇匀，放回37恒温箱继续培养至72 h。2气干法制片 (1) 收集细胞：将培养瓶中的培养物用吸管移入刻度离心管内，离心810 min（1000 r/min），弃上清液，为防沉淀物中细胞丢失，可适当留点上清液。(2) 低渗：向离心管中加6m1预温37的0.075 mol/l kcl低渗液，用吸管向离心管底部充气，轻轻将细胞沉淀冲散打匀，离心管放入37水浴箱中低渗处理15 min。(3) 预固定：低渗处理后，加carnoy固定液约0.51 ml，用吸管轻轻冲打混匀，预固定；然后离心810 min(1000 r/min)，弃上清液。预固定可防止细胞在固定时集聚成块。(4) 固定：在沉淀物中加carnoy固定液5 m1，用吸管将沉淀物轻轻冲打均匀，室温下静置固定20 min，离心810 min(1000r/min)，弃上清液。固定有利于染色体在载玻片上展开，保持染色体结构完整；如固定不充分，则染色体形象模糊