第六章-人工染色体.ppt

1、第六章人工染色体，生物体的许多重要性状涉及复杂的生理生化反应系列，由多个基因或基因簇控制，并与数百万至数千个碱基的DNA片段有关。复杂基因组的物理作图和基因的定位克隆也涉及到对大的DNA片段的研究。因此，提高载体的容量一直是克隆载体的重要发展方向之一。随着脉冲电泳技术的发展和基因组研究的深入，能够插入大片段的克隆载体人工染色体的研究取得了快速进展。所谓人工染色体是一种能够在生物细胞中独立“稳定存在和遗传”的人工重组DNA分子。酵母人工染色体，YAC，1000kb)，细菌人工染色体(BAC，300kb)，源自P1哺乳动物人工染色体的人工染色体，正在研究的人工染色体，摘要，1。YAC的基本序列元素

2、是酵母染色体DNA自主复制序列(ARS)、着丝粒序列(cen)、酵母染色体端粒序列(tel)、YAC酵母人工染色体的第一段，YAC载体主要用于构建大型DNA文库，特别是构建高等真核生物基因组文库，不用于常规的基因克隆。正常酵母人工染色体包含：*位于染色体末端的四膜虫端粒序列，用于保护线性DNA不被胞内核酸酶降解，并形成稳定的结构；酵母自主复制序列(ARS)的一种特殊序列，它包含酵母中双向复制DNA所必需的信号。酵母着丝粒(CEN)是有丝分裂期间纺锤体丝的结合位点，这使得染色体在有丝分裂期间被正确地分配给子细胞。在YAC中，它可以确保一个细胞中只有一条人工染色体。PYAC4:酵母第四条染色体的着

3、丝粒。YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因TRP 1:色氨酸生物合成基因缺陷型URA 3:尿嘧啶生物合成基因缺陷型LEU 2:亮氨酸生物合成基因缺陷型SUP 4:赭曲霉突变抑制基因作用方式：与YAC载体一起工作的宿主酵母(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因携带赭曲霉突变ade 2-1。具有这种突变的酵母在基本培养基上形成红色菌落，并且当细胞中存在具有赭石突变抑制基因sup4的载体时，它可以抑制ade 2-1基因的突变效应并形成正常的白色菌落。因为酵母的染色体是线性的，所以在工作状态下也是线性的。然而，为了便于YAC载体的制备，YAC载体以环状方式存在，并且添加普通大肠杆菌质粒载体的复制元

4、件和选择标记用于保存和增殖。二、克隆策略：YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因经限制性内切酶消化成为大片段DNA，克隆到酵母载体DNA中，转染到酵母收缩细胞中，扩增，根据标记性状筛选出重组人工染色体；第三，YAC克隆系统的特点；首先，YAC是一种可以提供大片段DNA的方法。简化构建染色体延伸图和分离完整基因(200500kb，甚至1000 KB)的过程。2.以酵母为宿主重建大的人类基因片段，可以将小的重叠基因片段转化为大的重叠基因片段。3.酵母作为真核生物，为其他真核生物提供了更合适的环境。4.YAC克隆系统的缺点，首先，YAC载体中的插入片段将会丢失。其次，很容易形成嵌合体。嵌合现象是指单

5、个YAC中的插入片段由两个或多个相连的独立基因组片段组成。嵌合克隆约占总克隆的5P%。YAC的染色体大小与宿主细胞相似，这影响了YAC载体的广泛应用。YAC染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源染色体相似，难以分离，不利于进一步分析。返回，第2节细菌人工染色体，1。生物活性炭特性1。它是以大肠杆菌F因子的重要位点和基因为主体的高通量低拷贝质粒载体。2.f因子，也称为生育因子，是一个100kb的质粒，可以整合到宿主染色体中。并且可以高频率地转移遗传标记。因子f在大肠杆菌中的复制受到严格控制，并保持低拷贝，通常每个细胞12个拷贝。其parB基因可以排斥细胞中的外源f质粒，限制细胞中质粒分子的

6、重排，减少外源基因在BAC中的重组和嵌合。带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常只有一个拷贝(重组缺陷型，rec)。这一特征有利于保持DNA大分子在细胞中稳定复制而不发生重组。特别是具有许多重复序列的DNA大分子被克隆到350 KB，F因子具有携带1Mb插入片段的潜力，这使得构建具有大容量克隆能力的载体成为可能。由基因工程改造的因子组成的生物活性炭载体可用于克隆100 kb以上的基因片段。1992年，静雅利用F因子的复制起点和氯霉素抗性标记基因，构建了第一代基于F质粒的BAC人工染色体。它可以克隆和保存大于100kb的DNA。新一代BAC载体是一个7.4kb的环状质粒：f因子的parA、pa

7、rB和parC基因，以确保大肠杆菌分裂时低拷贝BAC质粒均匀分布到子代细胞中。oriS基因：复制子来源于严格控制大肠杆菌f因子(生育因子)，解旋酶基因repE:一种三磷酸腺苷驱动的解旋酶选择标记基因，易于进行DNA复制。Cmr氯霉素抗性基因cosN来自噬菌体的CosN位点。BAC可被末端酶切割，使非识别序列线性化，且位点非常罕见。重组体经非消化后，可获得完整的插入片段。lacZ基因、外源基因插入Cre/loxP的颜色识别重组体：从P1噬菌体来看，Cre重组酶基因和loxP位点位于P1噬菌体基因组中，loxP是Cre酶的识别序列，利用Cre/loxP直接构建外源基因的限制性酶谱；第三，BAC的优

8、势，以大肠杆菌为宿主，BAC载体的承载能力一般为100350kb，转化率高，比YAC文库更容易构建BAC文库。BAC载体以环超螺旋状态存在。当生物活性炭载体被卸载时，其大小约为7.5kb，并在大肠杆菌中以质粒的形式复制。它具有氯霉素抗性基因。外源基因组DNA片段可通过酶切和连接克隆到BAC载体的多个克隆位点，连接产物可通过电穿孔导入重组大肠杆菌缺陷株。装载外源基因的重组质粒通过了氯霉素抗性和Lac Z基因的互补筛选。BAC复制子来源于f因子，可稳定遗传，嵌合和重组现象较少。靶基因可以通过菌落原位杂交进行筛选。方便BAC载体在克隆位点两侧有T7和SP6聚合酶启动子，可用于转录以获得核糖核酸探针或

9、直接用于插入片段的末端测序。像噬菌体一样，P1噬菌体外面有一层蛋白质外壳。它含有一个大的线性脱氧核糖核酸(110115kb)，并在体外包装在P1壳中。P1进入宿主细胞后被环化和扩增。1994年，有人将P1和F因子克隆相结合，产生了P1人工染色体克隆系统PAC。第3节其他人工染色体，第1节。P1人工染色体克隆系统& PAC，基于PAC的人类基因组文库的插入大小在60kb到150kb之间。2.人类人工染色体，返回，1。自上而下策略：基于天然染色体的断裂片段，主要通过以下方法获得新的HAC片段：(1)低剂量辐射(端粒定位)染色体截断技术；(2)定点插入后外源片段被扩增；(3)自然染色体在有丝分裂过程中自发形成，外源端粒被整合到哺乳动物染色体中，可以截断染色体并在断裂端产生新的端粒。研究人员利用这种技术修剪哺乳动物的染色体，并成功构建了一系列大小从0.56不等的染色体。起初，端粒整合位点是随机的，但现在，研究人员可以将端粒插入染色体的特定位点。(2)自下而上策略这种策略是将着丝粒、端粒和复制起点组装在细胞内或细胞外来构建HAC。研究人员运用这一策略，在1080个细胞中获得了第一个。他们用人类17号染色体的卫星、人类端粒和人类基因组的随机片段共转染了1080个细胞。重组后，含有着丝粒、端粒和复制起点并遵循染色体结构正常序列的重组连