支原体污染-细胞培养技术

1、,支原体污染及防治,从门外汉角度谈,1,1,支原体污染易被忽视,1.培养液可不发生混浊 2.细胞病理变化轻微或不显著 3.细微变化也可由于传代，换液而缓解。 4.个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落,2,2,支原体高污染率,国内外研究表明，在细胞培养中，支原体感染率达到30-60%,支原体污染已成为世界问题！,3,3333333,支原体的生物特性,是目前发现的最小细胞，直径约为0.13-0.18m。 无细胞壁，不能维持固定的形态，变形能力大。 革兰氏染色不易着色或呈阴性。 胞膜中含有胆固醇或其他甾醇。 多数支原体适合在偏碱性条件下生存（pH值7680），对酸耐受性差。 对热比较敏感

2、，对一般抗生素不敏感。,4,支原体污染的类型,口腔支原体(M.orale) 精氨酸支原体(M.arginini) 猪鼻支原体(M. hyorhinis) 发酵支原体(M.fermentans) 梨支原体(M. pirum) 莱氏无胆甾原体(A.laidlawi）,5,支原体污染的来源,操作者无菌操作技术不当、 污染之培养基、血清、细胞等。 操作室环境不佳、实验器具不洁。,6,科研人员的困惑,有些实验结果仅能在支原体阳性的细胞中得到,也曾有利用肿瘤细胞制备的单克隆抗体实为针对所污染的支原体的抗体。还有的科研成果,他人无法重复,也因所用细胞有支原体污染所致。,实验结果真实性和可靠性大大下降,7,支

3、原体污染对细胞的影响,1、影响细胞的生长状态及形态 支原体可使培液中支持细胞生长的营养物质含量减少，造成细胞生长缓慢甚至停止；另外还会导致细胞微管解聚，引起细胞一系列病变，表现为细胞收缩、贴壁细胞脱落、裂解等。,8,支原体污染对细胞的影响,9,支原体污染对细胞的影响,2.影响细胞的代谢和功能 （1）培液中的精氨酸被支原体大量消耗，引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍； （2）支原体活动使培液成分发生改变（如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质），影响细胞代谢。 （3）支原体吸附在细胞表面，破坏细胞膜的完整性，影响细胞信号传递；,10,支原体污染对细胞的影响,（4）支原体消耗细胞的核

4、苷库染色体异常,11,12,支原体污染对细胞的影响,3、其他 此外，支原体污染还会影响一些病毒在细胞中的产量、使恶性细胞致癌能力下降、影响淋巴细胞分化等。,13,支原体污染的检测方法,培养法 DNA荧光染色法 聚合酶链反应(PCR)法 电子显微镜法 相差显微镜检测 3-H胸腺嘧啶掺入法 酶联免疫吸附试验、免疫荧光法 低张处理地衣红染色观察,14,支原体污染的常用检测方法,1.培养法：原理是利用营养丰富的培养基,直接对待检细胞、血清等进行支原体培养。,支原体集落呈“油煎蛋”样,缺点：灵敏度低，试验周期长，不能检测到种且不适用于检测所有支原体。,15,支原体污染的常用检测方法,DNA荧光染色法 利

5、用荧光Hoechst33258标记细胞和支原体DNA,在紫外光(波长为630 nm)激发下产生黄绿色荧光,利用荧光显微镜观察支原体是否存在。,16,支原体污染的常用检测方法,缺点：有时易出现假阴性和假阳性,17,支原体污染的常用检测方法,PCR法：通过扩增被检测标本中的支原体DNA ,再进行琼脂糖凝胶电泳。电泳完毕,将电泳胶在紫外投射仪下观察,根据标准分子量及阳性对照、内对照条带,观察待测样品中是否有阳性条带。,18,应对支原体污染的策略一,细胞一旦发生了支原体污染,应当弃之。虽然已有了针对支原体的抗生素及最近出现的所谓支原体清除剂,这些方法只能杀灭细胞外的支原体。 除非是不可替代或无法重新获

6、得的细胞一，般没有必要进行支原体清除工作。,19,支原体的清除方法,20,支原体的清除方法,新一代支原体抗生素M-Plasmocin 其含有两种杀菌成分,一种成分通过干扰核糖体的翻译功能而使蛋白合成受阻。另一种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA的复制。 可以强效对抗支原体及相关的无胞壁的细菌,同时又不影响细胞本身的代谢,且处理过的细胞不会重新感染支原体,是目前对抗支原体最理想的方法。,21,M-Plasmocin,支原体感染的细胞,经M-Plasmocin处理过的细胞,22,应对支原体污染的策略二,1.从可靠来源引进、使用细胞,特别是知名的信誉良好 的专门机构,如ATCC、基础医学细胞中心等,这些机构对细 胞质量进行一系列检测。 2.预防为主:细胞培养实验室应制定严格的管理制度, 按照规范的实验程