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1、胱抑素C诊断试剂的介绍,迈克技术部,一、Cystatin C的生物学特征,1961 年Clausen 于脑脊液中发现一种物质,因它与哺乳动物胱蛋白A 和胱蛋白B 的结构及活性相似,当时被称为胱蛋白C 。1985 年cystatin C 首次被报道可作为评估GFR 的指标,称为半胱氨酸蛋白 酶抑制剂C （中译文胱抑素C）。 Cystatin C 是一种非糖基化的碱性蛋白质,由120 个氨基酸组成,相对分子质量是13. 36 103 ,等电点为9. 3 ,特点为位于羧基端附近有2 个二硫键。人的cystatin C基因片段位于20 号染色体上,其基因序列在大多数组织中能稳定表达。 通过基因结构和启

2、动子研究,人体所有有核细胞均可产生cystatin C ,生成速度稳定、不受炎症、胆红素、溶血、甘油三酯的影响,且与性别、年龄、肌肉量无关【1】。它主要分布于细胞外液,精液中浓度最高,其次,脑脊液浓度相对高于血中浓度,唾液、胸水中均含cystatin C;另外,某些细胞如神经细胞、甲状腺细胞、胰岛细胞内也有发现。,【1】 Randers E Erlandsen EJ Serum cystatin C as an endogenous marker of the renal function；areviewJClin Chem Lab Med，1999，37(4)：389-395,总之，cyst

3、atin C在体内的代谢特点： 肾脏是唯一的排泄器官，在近端肾小管上皮细胞被完全分解,不再重 返血流，也不被肾小管上皮细胞分泌 能自由通过肾小球滤过膜；生成速度和血浓度稳定,不受其他病 理变化影响。表明它是测定GFR 的一种理想指标,cystatin C相对分子质量低，等电点高，二者使cystatin C 能被肾小球自由滤过，然后在近曲小管上皮细胞内分解代谢，不被肾小管重吸收和分泌。,返 回,二、目前临床测定GFR常用指标的比较分析,目前,临床用来评价肾小球滤过功能的指标可分为外源性和内源性两大类。前者包括菊粉和一些放射性核物质,后者包括肌酐(Cr) 、尿素氮(BUN) 、尿酸(UA) 和2

4、微球蛋白(2-MG) 、视黄醇结合蛋白(RBP) 等低相对分子质量蛋白质。它们都有各自的局限性,现分述如下。,2. 1 BUN（尿素氮） BUN 是蛋白质代谢产生的氨在肝脏经鸟氨酸循环生成的终产物,经肾小球滤过,大部分随尿排出,小部分被肾小管重吸收入血。由于肾脏代偿功能强,60 %70 %肾单位功能受损时,BUN 才高于正常,敏感性差,所以,不能作为肾功能早期受损的指标。,2. 2 Cr（肌酐） Scr 是肌酸的代谢产物,经肾脏排泄,肾小管有少量分泌。GFR 下降至正常1P3 时,Scr 才明显上升。Scr 还受肌肉量、肉食摄入量及体内代谢水平的影响,儿童、老年人、消瘦者中,测值偏低,不能真实

5、反映GFR。,2. 3 低相对分子质量蛋白质 2-MG, 视黄醇结合蛋白（RBP） 等能反映早期肾功能变化,当GFR 80mL/min 时,2-MG已升高。但易受病理状态影响,且血浓度不稳定,在感染、炎症、恶性肿瘤、肝病时,其生成速度加快,影响其真实性。 2. 4 菊粉和放射性核素物质 菊粉和放射性核素物质,影响因素较少,被认为是测定GFR 的金指标。但是,菊粉清除率操作复杂,仅在实验研究中应用。测定放射性核素物质的清除率,价格昂贵,具放射性。某些患者如孕妇不适用,限制其临床应用。,总之,从临床应用角度出发,有必要寻找一种既符合评估清除率标记物特点,又经济适用,能在临床推广的物质来监测早期受损

6、的肾功能,及时反映肾功能的变化,指导临床治疗。作为评估清除率的标记物应具以下特点: 稳定的生成率。 稳定的血浓度,不受其他病理变化的影响,不与蛋白质结合。 肾小球自由滤过,不被重吸收或分泌。 近年来,国外研究指出,半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C) 具有上述特点,是评估肾功能的一种敏感性好、特异性高的指标。,返 回,Cystatin C在体内产生速率稳定,影响因素极少,是反映早期肾小球滤过功能受损的一个更理想、更可靠的指标,测定cystatin C来指导诊断及治疗,具有重大的临床意义。,目前常规使用血肌酐和尿素氮水平及内生肌酐清除率(Ccr) 作为评估GFR 的参数,它们的测定方法

7、相对固定,可迅速获取结果,但一些肾性和非肾性的因素可干扰这些结果, 如表所示 :,1. 血Cyst C 在评价肾功能中的应用,三、Cystatin C的临床应用,1）分子量小,携带正电荷,可自由通透肾小球基底膜; 2）被近曲小管重吸收及完全代谢,无肾小管的分泌; 3） 在组织中产生的速率恒定;排出只受肾小球滤过率的影响, 而不受其他因素如性别、年龄、饮食、炎症、感染、血脂、肝脏疾病等的干扰。,近年研究发现血清Cyst C 与GFR 的相关性较Scr 与GFR 的相关性更显著。如下表列举了不同作者在研究中得到的二者相关性的数值【2】。,【2】 OlmegunAMojimiiri，IlabilaA

8、bdellaEvaluation ctcrst c and 一mierogtobulin aB malkm 0f renal function in patients with type2 dimellitllB8J Diab Comlalleatiom，2003，17：160168,Cyst C 的特点:,尽管相关系数( r) 是一个非常不敏感的指标，但上述不同样本中Cyst C 与GFR 的相关性均明显高于Scr与GFR 的相关性。有些作者使用敏感的ROC 曲线分析也得出相同结果。同时血Cyst C 判定肾功能减退的敏感性优于血肌酐。,在肾移植术中，移植肾的GFR 可作为观察急、慢性排斥反

9、应及免疫抑制剂的肾毒性指标之一，靠缓慢升高的Scr 来检测GFR ，不能及时、准确反映移植肾功能。因此,cystatin C可作为肾移植中肾功能的监测指标。,2. 肾移植中的应用,随着社会生活水平提高,糖尿病人数不断增加,1/3 患者发展为肾衰竭及需要肾透析。目前DN已成为全球范围内最常见的慢性肾功能不全的原因之一，所以,需要一个敏感、可靠的GFR 检测指标来评价糖尿病患者的肾功能。通过GFR 及微量白蛋白尿的评估可早期发现DN患者的肾脏改变。虽然目前微量白蛋白尿在临床应用广泛,但昼夜排泄量不同,运动、尿路感染、高血压、心功能不全及急性发热均能影响其结果。更重要的是微量白蛋白尿是反映DN 发生

10、的较晚期的标志,因此寻找DN 的早期标志物或DN 发生发展的筛查指标是目前临床重要课题。 Mojiminyi 等认为,如果将微蛋白尿认为是检出糖尿病肾病的“金指标”,那么,与之相比,cystatin C 检出糖尿病肾病的灵敏度为40 % ,特异性为100 % 。所以,血cystatin C是一个比较敏感和实用的指标。在刚患糖尿病而无证据有肾病患者中,定期开展血清cystatin C检测以观察其与糖尿血管病变的关系,是必要的和可能的。,3. 在糖尿病中的应用,据估计，我国约有高血压患者超过一亿人，其中40%以上的高血压病患者到中、晚期可并发高血压肾病。临床定期监测高血压病患者的血清cystati

11、n C水平对高血压病所导致的早期肾功能损伤的观察与早期预防、诊断和治疗具有很重要的临床意义。,在儿童中血肌酐的浓度是随着年龄的增长逐步上升的,直到成年才达到稳定,因此运用Scr 评定儿童肾功能有一定困难。近年来有学者在测定258 位没有肾脏疾病的正常儿童血Cyst C 时发现:出生后13 天内血Cyst C 的浓度非常高,可达1. 642. 59mg/ L ,在生后4 个月内迅速下降,1 岁左右其浓度逐渐稳定,大约是0. 71. 38mg/ L 。，因此有可能直接利用Cystatin C的测定结果，而不经体表面积或体重的转换来反映肾小球滤过功能改变。因此同成人相比血Cyst C 作为GFR 的

12、衡量标准同样适用于儿童且有其独到之处。,5. Cyst C 在儿科疾病中的应用,4. 在高血压病中的应用,对化疗病人来说，很可能会导致肾功能的损害，因为化疗药物对肾小管 有一定的损伤。 因此对进行化疗药物治疗的病人应及时关注其肾脏功能的状况，以适当调整药物剂量。 据报道，通过对接受顺氯氨柏(cisplatin) 进行化疗的肿瘤病人研究表明，Cys C 与GFR 的相关性比SCr 好(r = 0. 84 及r = 0. 74) 。 许多研究都比较一致地认为对化疗病人检测Cys C 比检测SCr 更有意义【3】。,【3】KaZIlo IJehida，Akiko Gotoh1leuurment 0f

13、 cystaliIl c and clealinille inurineCliniea Chimiea Aeta，20o2，323：121128,7. Cys C 在化疗中的应用,8. 血清胱抑素C与急性心衰 芬兰的教授最新研究表明，在急性心力衰竭的患者中，血Cystatin C对心衰患者预后的预测要高于其他指标(如：胆钠素、BNP、肌钙蛋白T) ，可以成为反映急性心力衰竭预后的一个敏感指标。该教授对622名有心衰老年人的研究中表明：血Cystatin C越高,死亡越高。将胱抑素C分为三个浓度组（附表说明）：,返 回,四、Cystatin C检测方法学的发展 4.1 非均相检测方法 :尽管19

14、61年Clausen J在脑脊液中发现了Cys C，但直到1979年Ltberg和Grubb4采用酶免疫分析(EIA)的方法对血液中的Cys C进行了定量分析，这种方法的检测限为(30pgL)；耗时(需16h)；操作繁琐，用于常规检测受到限制。此后相继出现了放射免疫、荧光免疫和各种酶免疫方法用于血清Cvs C的检测，这些方法较大程度的提高了检测的灵敏度，但由于这几种免疫方法的抗原抗体都是自行设计制备而成，其异质性影响了检测的标准化，因而Cvs C的诊断价值一直未能被确定。,4 LStlrgH，(；rubbAQuantitation ct“Ytlallceih|mmbiologicalfluid

15、s indicationsforproductioninthe central nelVOll8 sy,a Seam JClin LibInVlSt， 1979，39：619626,1993年德国科学家Monika Pergande和Klaus Jung 5采用夹心酶免疫分析的方法检测血清中的Cys C，该法所采用的抗体是通过商业渠道获得的，灵敏度高，检测限为09vL，可以在两小时内完成，批内和批间变异分别是5和88，并证实血清Cys C在评价肾功能中比传统的血肌酐和&一微球蛋白有更高的诊断灵敏度 上述各种非均相的检测方法，难于自动化，检测耗时，操作繁琐，不能作为理想的常规方法，更无法用于急诊

16、检测。,5 lonikaPergande，KIall Sandwich enzymeim if crst cinum With commercially available antibodiesClin them，1993，399：1885 189o,4.2均相检测方法 胶乳免疫分析结合反应是基于将已经结合有特异性抗体的胶乳颗粒直接与相应抗原粘着的免疫方法，是一种均相的检测方法。回收率平均为98；抗干扰强，在类风湿因子1994年Jan kyhseAndersen6等报道了用一种快速自动化的颗粒增强透射免疫比浊法(PETIA)测定血清Cys C，该方法可以对未稀释的血清及血浆进行检测，每小时可以

17、完成90份样本的检测工作，急诊样本的分析可以在7分钟内完成；该法的检测最低限为150微克升，能检测到比传统非增强检测法低10100倍的蛋白质浓度，检测范围为0.414.1mgL，包括了所有健康人和病人血中Cys C的浓度范围；其批内和批间变异分别为0.9和2.2，用重组Cys C标准晶作回收实回收率平均为98；抗干扰强，胆红素150微摩尔/升；血红蛋白 1.2 克/升和甘油三酯85mmolL时不受干扰；该法简化了分析程序和样本处理时间，分析快速而准确。 这种均相的分析方法易于自动化，耗时少，操作简便，适合急诊样本的检测，可以成为理想的临床常规检测方法。,6Jan K，h Andellll，CA

18、millt Sehmidt，et a1SenIm eystatin c，determined by B rapid，automated particleenhanced turbidimetrie method，is a betterIll elthan Belllm ereatinine for glomen filtration rateClin Chem，1994，4010：19211926,返 回,五、本公司Cystatin C诊断试剂产品说明 5.1 试剂盒检测原理： 样品中的Cystatin C与试剂盒中的胶乳颗粒增强的抗Cystatin C抗体试剂发生抗原-抗体反应，使反应液浊度增加，并在一定范围内反应液浊度与所加的抗原的量呈线性相