第七章微生物生长及其控制.ppt

1、第七章 微生物的生长繁殖 及其控制,微生物生长的研究方法 微生物的生长规律 环境因素对微生物生长的影响 微生物生长的控制,第一节 微生物生长的研究方法,平板划线分离法,稀释倒平板法,单孢子或单细胞分离法,利用选择性培养基分离法,一、微生物纯培养获得方法,1.平板划线分离法,用接种环无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线或分区划线，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,2.稀释倒平板法,3.单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生

2、物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,4.选择性培养基分离法,各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。,微生物纯培养分离方法的比较,二、微生物的培养方法 好氧培养 厌氧培养,同步生长：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间处于同一生长状态的生长。 同步细胞：进行同步生长的细胞。 同步培养法：使培养物中所用细胞都处于同步生长的培养方

3、法。,三、微生物的同步培养,获得同步生长的方法,过滤法,将不同步的细胞培养物通过孔径大小不同微孔滤器，从而将大小不同的细胞分开，分别将滤液中的细胞取出进行培养，获得同步细胞。,离心法,将不同步的细胞培养物悬浮在不被这种细菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液里，通过密度梯度离心将不同细胞分布成不同的细胞带，每一细胞带的细胞大致是处于同一生长期的细胞，分别将它们取出进行培养，就可以获得同步细胞。,膜洗脱法,原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。 步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培

4、养。,诱导法,温度 培养基成分 光照,采用物理、化学因子使微生物细胞生长进行到某个阶段而停下来，使先到达该阶段的微生物细胞不能进入下一生长阶段，待全部群体细胞都到达该生长阶段后，再除去该因子，使全部群体细胞同时进入下一个生长阶段，以达到诱导微生物细胞同步生长的目的。,四、微生物的连续培养,分批培养 ：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获的培养方式。 连续培养 ：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。,连续培养理

5、论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。,当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,连续培养原理,按控制方式分,内控制 （控制菌体密度）：恒浊器 外控制 （控制培养液流速）：恒化器,连续培养器,连续培养技术恒化连续培养,概念：维持培养基总体积不变，通过控制培养基中某一生长限制性底物浓度来调节微生物的生长速率及其细胞浓度的培养技术。 特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物

6、生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究。,恒化器Chemostat,概念：通过调节培养基流速，使培养液中微生物细胞密度保持恒定的连续培养方法。 原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。,连续培养技术恒浊培养,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,恒浊培养装置,恒浊器与恒化器的比较,连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。 优点： 高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗

7、发酵罐等单元操作； 自控：便于利用各种仪表进行自动控制； 产品质量稳定 节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。 缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。 连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年。,五、微生物生长繁殖的测定方法,微生物细胞数目检测 直接法（血球计数板、涂片计数法） 间接法（活菌计数法、比浊法、薄膜过滤法） 微生物生长量和生理指标测定 直接法(称重法) 间接法（比浊法，碳、氮含量测定等） 丝状微生物菌体生长速率测定,1.血球计数板法,原理：将1mm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小

8、格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。 特点：快速，准确；,1.血球计数板法,缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,2.涂片染色法,应用：可同时计数不同微生物的菌数，适于土壤、牛奶中细菌计数。 方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取0.01ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代 入公式： 每ml原菌液含菌数 =视野中平均菌数涂布面积/视野面积100 稀释倍数,3.活菌计数法,技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完成操作），严格无菌操作； 注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注

9、平板时的培养基温度； 适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物。,3.平板菌落计数法,4.比浊法,在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光吸收值越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。,5.薄膜过滤计数法,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。 将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,6.湿重法,将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，称重。,7.干重法,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离

10、出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。 该法适合菌浓较高的样品。,8.生理指标法,测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。 其他方法 测定碳、磷、DNA、RNA等。,凯氏定氮原理及方法,蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨

11、游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。,9.培养基或培养料中菌体生长速率测定法,测定一定时间内在固体培养基表面的菌落直径的增加值。 测定一定时间内在固体培养料中菌丝体向前延伸的距离。,10.单个菌丝顶端生长速率测定法,光学显微镜目镜测微尺,显微镜测微尺的使用,目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中间像重叠）来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测

12、量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。,镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0m（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。,校正时，将镜台测微尺放在载物台上.由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微

13、尺在同样放大倍数下测量微生物大小。,目镜测微尺的校正: 把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0m，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。,目镜测微尺小格刻度= 10m镜台测微尺格数/目镜测微尺格数 例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺10小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0m，则目镜测微尺上每小格长度为=5

14、10m/105m,第二节 微生物的生长规律,一、微生物的群体生长,无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌。 其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的。 由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（eneration time, G ），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，有时也称为倍增时间。,（一）无分支单细胞微生物的群体生长,1.无分支单细胞微生物的群体生长特征,右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。,指数生长可以用下式表示： b = B2n,B 为

15、起始细胞数目 b 为指数生长某个时刻t时的细胞数目， n 为世代数,代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。,代时研究意义及特点,代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为13h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。,一些细菌的代时,菌名培养基培养温度 代时 E. coli（大肠杆菌） 肉汤 3717min E. coli

16、牛奶 3712.5 Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶 371618 E. aerogenes 组合 372944 B. Cereus（蜡状芽孢杆菌）肉汤3018 B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌）肉汤5518.3 Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌）牛奶376687 Streptococcus lactis（乳酸链球菌）牛奶3726 S. lactis乳糖肉汤3748 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）肉汤3723.5 Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）组合271200,不同温度下的代时

17、,温度对微生物的代时有明显影响： E. Coli 在不同温度下的代时 温度（）代时（分）温度（）代时（分） 108603522 151203717 20904017.5 25404520 302947.577,2.无分支单细胞微生物的群体生长曲线,以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。 生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。 每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。,2.无分支单细胞微生物的群体生长曲线,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在

18、适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,生长曲线的制作,又称：停滞期、调整期、适应期、迟缓期 1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。 2.特点： 生长速率常数= 0； 细胞形态变大或增长； 合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快）。 3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物,延滞期（lag phase）,菌种：繁殖速度较快的菌种的延滞期一般较短； 接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延滞期较短，甚至检查不到延迟期； 接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延滞期； 培养基成分： 在营养成分

19、丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短； 接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延滞期长短的因素,认识延滞期的特点及形成原因对实践的指导意义,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的缩短措施： 增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，使接种前后培养基成分和培养条件一致； 选用繁殖快的菌种。 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,对数期（logarithmic phase）,又称：指数期 现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 特点： 生长速率常数

20、最大，即代时最短； 代谢最旺盛,对数期（logarithmic phase）,影响因素： 菌种 营养成分 营养物浓度 培养温度,应用意义： 由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳菌龄； 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度； 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期； 是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。, 稳定期（stationary phase）,又称：恒定期或最高生长期 特点： 新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的总菌数达到最高值。 细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。 此时期的微生物开始合

21、成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。, 稳定期（stationary phase）,产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调，如碳氮比不合适; 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）； 物化条件（pH、氧浓度）不合适。,应用意义： 1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。, 衰亡期（decline phase）,特点： 细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现

22、“负生长”。 细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。 因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。 衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。, 衰亡期（decline phase）,产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,3.微生物生长与代谢产物形成的关系,初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；,次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的

23、形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期。,（二）丝状微生物的群体生长,丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。,1.生长停滞期 2.迅速生长期 3.衰退期,1.生长停滞期: 造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。 2.迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌

24、丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。 3.衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。,4.丝状微生物的群体生长,微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用:一方面,各种各样的环境因素对微生物的生长和繁殖有影响,另一方面,微生物生长繁殖也会影响和改变环境.研究环境因素与微生物之间的关系,可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面,同时防止它有害的一面.,第三节 环境因素对微生物的影响,影响微生物生长的外界因素很多，除了前面讲过的营

25、养因素之外，还有许多物理化学条件。 本节主要内容： 一、温度对微生物生长的影响 二、氧气对微生物生长的影响 三、pH值对微生物生长的影响,温度是影响微生物生长的最重要因素之一。 温度对微生物的影响具体表现在： 影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。 影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。 影响物质的溶解度，对生长有影响。,一、温度对微生物生长的影响,每种微生物都有自己的生长温度三基点: 最低、最适、最高生长温度,处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。 超过最低生长温度

26、时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。 超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。,（一）微生物生长的三个温度基点,1.高温对微生物的影响 高温下蛋白质、核酸或其他成分不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构。,高温与低温对微生物的影响,当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖能力降低，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。 低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4的冰箱中。 当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡

27、。,2.低温对微生物的影响,造成死亡的原因： 冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。,（二）微生物生长温度类型,嗜冷微生物 嗜温微生物 嗜热微生物,嗜冷微生物: 最适生长温度在15或以下，主要分布在地球的两极、冷泉、深海、冷冻场所及冷藏食品中。 例：假单孢菌中的某些嗜冷菌在低温下生长，常引起冷藏食品的腐败。,嗜冷微生物在低温下生长的机理 据推测有两种原因： 它们体内的酶能在低温下有效地催化，在高温下酶活丧失; 细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，低温下也能保持半流动状态，可以进行物质的传递。,嗜温微生物： 最适生长温度为2540 ，大多数微生物属于此类。 室温型主要为腐生或

28、植物寄生，在植物或土壤中。 体温型主要为寄生，在人和动物体内。,嗜热微生物： 最适生长温度为50 60 ，主要分布在温泉、堆肥和土壤中。 高温下能生长的原因： 酶或蛋白有较强的抗热性； 细胞膜中饱和脂肪酸含量高，较高温度下能很好地发挥功能。,影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力； 改变酶活性、酶促反应的速率及代谢途径； 环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收。,二、环境pH值对微生物生长的影响,微生物的生长pH值范围极广，从pH8都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。 微生物生长的pH值三基点： 最低、最适和最高pH值

29、。,（一) 微生物生长的PH三基点,不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为： 嗜酸性微生物：5.4硫杆菌属等 嗜中性微生物：5.48.5 大多数微生物 嗜碱性微生物：7.011.5 硝化细菌、尿素分解菌等,（二) 微生物pH类型,微生物 生长最适pH 合成抗生素最适pH 灰色链霉菌6.36.96.77.3 红霉素链霉菌6.67.06.87.3 产黄青霉6.57.26.26.8 金霉素链霉菌6.16.65.96.3 龟裂链霉菌6.06.65.86.1 灰黄青霉6.47.06.26.5,生长的最适pH值与发酵的最适pH值,同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生

30、化过程中，对环境pH值要求不同。 例如：丙酮丁醇梭菌 在pH值=5.5-7.0时，以菌体生长为主 在pH值=4.3-5.3时，进行丙酮丁醇发酵,同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累不同的代谢产物。 例如：黑曲霉 pH值=2-3时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。 pH值在7左右时，产物以草酸为主，只产少量柠檬酸。,（三）微生物细胞内的pH值,虽然微生物生活的环境pH值范围较宽，但是其细胞内的pH值却相当稳定，一般都接近中性。 这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境

31、pH值。,微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群: 专性好氧菌 好氧菌 微好氧菌 兼性好氧菌 耐氧菌 厌氧菌 严格厌氧菌,三、氧气对微生物生长的影响,氧浓度对不同微生物生长的影响,专性好氧菌,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。通常生长在培养基表面附近。,微好氧菌,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。通常生长在培养基表面之下的某一区域。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠有氧呼吸产能，无氧时借助发酵或无氧呼吸产能

32、；细胞含有超氧化物歧化酶。在整个培养基中都有分布。,兼性好氧菌,耐氧菌,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。依靠发酵获得能量。细胞内存在超氧化物歧化酶和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,专性厌氧菌,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸提供；细胞内缺乏SOD，大多数还缺乏过氧化氢酶。,严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。 在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（

33、H2O2）、超氧阴离子（ O2- ）等。它们可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。,严格厌氧菌的氧毒害机制SOD学说,好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等， 严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,严格厌氧菌的氧毒害机制SOD学说,H2O + O2 2 O2 + 2H+O2 + H2O2 2H2O,O2 + eO2 ( O2 ) 超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。 超氧物阴离子歧化酶是在生物进化中发展出来的一种自我保护方式。,生物体中超氧阴离子的形成与去除,1 2,SOD 好氧生物 和耐氧细菌,过氧化氢酶

34、 好氧生物,过氧化物酶 NADH2NAD 耐氧菌,在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。 培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气； 培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气； 培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。,第四节 微生物生长的控制,1.高温灭菌法 高温可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。,一、常用物理方法,（一）温度,干热灭菌法 火焰灼烧法：将被灭菌物品在火焰中灼烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏性强。适用于接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。,干热灭菌法 干燥热空气灭菌法：将物品放入烘箱内，然后升温

35、至150-170 ，维持1-2小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，以及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。,湿热法： 特点：温度低、时间短、灭菌效果高 原因： 1) 菌体内含水量越高，则凝固温度越低； 2) 蒸汽冷凝会放出潜热； 3) 饱和水蒸汽穿透力强； 4) 热蒸汽易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。,高压蒸汽灭菌法 利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100以上高温灭菌的方法。 方法：121维持15-20min。 适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。,高

36、压 蒸 汽 灭 菌 锅,注意事项： 排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。,煮沸消毒法 将水加热至100，煮沸15min以上，可杀死物品上存在的细菌和真菌的营养细胞，但不能杀死全部细菌芽孢和真菌孢子。,巴斯德消毒法 低温维持法：62.9/30min 高温瞬时法: 71.6/15s 超高温瞬时法：134/1-2s,间歇灭菌法 将待灭菌物品在80-100蒸煮15-60min，冷却后搁置恒温箱（28-37）过夜，重复以上过程三遍以上。 蒸煮过程可杀死微生物的营养体，但不能杀死芽孢，室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体；循环三次以上可保证彻底灭菌的目的

37、。 适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。,低温低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制。 冷藏法：4，微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保存数周至数月而不衰竭死亡；食品保鲜,2.低温抑菌,低温低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制。 冷冻法：食品工业中采用-10左右的冷冻温度较长时间地保藏食品；冷冻法也可用作菌种保藏，但所需温度更低，如-80低温冰箱、或-78干冰、-80液氮中冷冻保存。,2.低温抑菌,（二）辐射 辐射：能量通过空间传递的一种物理现象。 与微生物有关的辐射： 电磁辐射：可见光、紫外光 电离辐射：、射线,电磁辐射 1.可见光 波长在400800

38、nm的电磁辐射为可见光。 大部分微生物不需要光，少数菌需要光作为能源。 一般来讲，可见光对大多数化能微生物没有影响，但是，太强或连续长时间照射也会导致微生物死亡。,2.紫外线（） 波长在100-400nm的电磁辐射为紫外线。 紫外线杀菌或诱变原理 紫外线作用于DNA，使其产生胸腺嘧啶二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成微生物变异或死亡。 紫外线会使空气中的分子氧变成臭氧，臭氧具杀菌作用。 其中波长在260-280nm处的紫外线杀菌力最强。 因为核酸（DNA、RNA）的吸收峰为260nm，蛋白质的吸收峰为280nm。,光复活现象：经紫外线照射的微生物，在可见光下，光可以激活D

39、NA修复酶，该酶能修复DNA上的损伤，使微生物的突变率或死亡率下降。,微生物对紫外线的抵抗力与以下因素有关： 照射时间：照射时间长，死亡率高。 照射强度：照射强度大，死亡率高。 微生物种类及生长阶段：革兰氏阳性菌比阴性菌抗性强；多倍体比单倍体抗性强；孢子和芽孢比营养细胞抗性强； 干燥细胞比湿润细胞抗性强。 应用：由于穿透力差，只适用于物体表面以及空气、水的消毒杀菌，也用于诱变育种。,电离辐射 电离辐射是一切能引起物质电离的辐射总称，其种类很多，高速带电粒子有粒子、粒子、质子，不带电粒子有中子以及X射线、射线。 射线是一种带电粒子流，由于带电，它所到之处很容易引起电离。射线有很强的电离本领，但由

40、于其质量较大，穿透能力差，在空气中的射程只有几厘米，只要一张纸或健康的皮肤就能挡住。 射线也是一种高速带电粒子，其电离本领比射线小得多，但穿透本领比射线大，很容易被铝箔、有机玻璃等材料吸收。,、射线，波长短，能量高，有较强的杀伤力。 作用原理 ：可引起水和其他物质的电离，形成离子和自由基，使核酸、蛋白质或酶发生变化，造成细胞损伤或死亡。 特点：穿透力强，非专一性，作用于一切细胞成分，对所有生物均有杀伤作用。 应用：用于杀菌或菌种诱变。,水活度：在相同的温度、压力下，体系中溶液的水的蒸汽压与纯水的蒸汽压之比,即A=p/p0. 微生物生长的水活度范围 ： A=0.630.99 各种微生物生长的最低

41、水活度值,（三）水分,渗透压和干燥都涉及到水分含量和水活度，它们对微生物的生长都有很大的影响。 1.干燥对微生物的影响 细胞失水造成代谢停止而抑制微生物生长，有时也可引起某些微生物细胞的死亡。,微生物对干燥的抵抗力与以下因素有关： 温度： 在相同的干燥环境下，温度高，微生物易死亡， 而在低温下不易死亡（例如冷冻干燥保藏菌种） 干燥速度：干燥速度快，微生物不易死亡，反之，易死亡 基质：在不同基质中对干燥的抵抗力不同，含有糖、淀粉、蛋白质等物质时，不易死亡。 微生物种类及生长时期：产荚膜菌比不产荚膜菌抗性强；小型、厚壁细胞的微生物比长型、薄壁细胞的微生物抗性强；细菌的芽孢、真菌的孢子比营养细胞抗干

42、燥性很强；老龄菌比幼龄菌抗性强。,2.渗透压对微生物的影响 胞外溶液的溶质浓度与胞内溶质浓度相等时，为等渗溶液； 溶液的溶质浓度高于胞内溶质浓度为高渗溶液； 溶液的溶质浓度低于胞内溶质浓度为低渗溶液。,等渗溶液中，微生物的活动保持正常，细胞外形不变； 高渗溶液中，细胞易失水，脱水后发生质壁分离，生长受抑制或死亡(盐渍和糖渍保藏食品)； 低渗溶液中，细胞吸水膨胀，甚至导致细胞破裂死亡。,大多数微生物，在含盐5%30%或含糖30%80%的高渗条件下生长受抑制或死亡。 耐高渗微生物,细菌中的嗜盐菌 低嗜盐菌： 2%5% 中嗜盐菌： 5%20% 极端嗜盐菌： 20%30% 高糖环境下生长的微生物 花蜜

43、酵母菌和某些霉菌能在60%80% 的糖溶液中生长 产甘油的耐高渗酵母能在20%40%的糖蜜中生长,采用滤孔比细菌还小的筛子或滤膜作成各种过滤器，当空气或液体流经筛子或滤膜时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，从而达到除菌的目的。 过滤介质：醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜 以及石棉板等。 应用：对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质除菌。,（四）过滤除菌法,二、常用的化学方法,消毒剂:可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂。主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。 防腐剂:可以抑制或阻止微生物生长，但对人体或动物体的毒性较低的化学药剂。用于肌体表面，如皮肤、粘膜、伤口等处防止感染，也有的用于食品、饮料药品的防腐作用。,