细胞凋亡2014年10月.ppt

1、病理学教研室 徐 曼,细胞凋亡及检测技术,概述 细胞凋亡的调控 细胞凋亡与疾病 细胞凋亡的检测,概述,apoptosis,一、细胞死亡的模式, Necrosis = 细胞病理性死亡 Apoptosis = 细胞自发性死亡,Concept of apoptosis: 体内外生理或病理因素触发细胞内死亡程序细胞死亡,细胞坏死与细胞凋亡的区别,细胞凋亡与细胞坏死的区别 特征 细胞凋亡 细胞坏死 诱导因素 生理及弱刺激 强烈刺激 受累范围 单个细胞 多个细胞 膜完整性 保持到晚期 早期即丧失 细胞体积 减小、固缩 增大肿胀 染色质 凝聚成半月形 稀疏成网状 细胞器 无明显变化 肿胀破坏 溶酶体 保持完

2、整 破坏外溢 细胞形状 形成凋亡小体 破裂成碎片 炎症反应 凋亡小体被吞噬 有 DNA分解机制 核小体间解离 随机降解 基因活化 ATP减少 （新蛋白质合成） 核酸内切酶激活 膜损害、自由基损害,凋亡的生理学意义: 胚胎发育期去除某些细胞 成人组织激素依赖性退化：子宫内膜、乳腺 维持内环境稳定 去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞 参与防御反应 细胞毒T细胞,凋亡过多或不足疾病： 肿瘤 艾滋病 缺血性损伤（心肌梗死、脑卒中） 病毒感染,二 、凋亡时细胞的主要变化,1. 形态学改变 （The morphologic characteristics of apoptosis） 凋亡细胞（实体细胞）与周

3、围细胞脱接触 细胞固缩（Condensation）、核固缩和发芽 胞膜空泡化（Blebbing） 凋亡小体（Apoptotic small body）,细 胞 凋 亡,(扫描电镜) 正常细胞,(扫描电镜) (透射电镜) 凋亡细胞凋亡小体,DNA片段化 （DNA ladding pattern）,核酸内切酶激活 核小体连接区DNA降解 180200bp整数倍的DNA片段,2. 生化改变 （The biochemical characteristics of apoptosis）,细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻,大分子合成 TFAR-19 高表达,细胞凋亡的调控,凋亡相关因素 凋亡的过程及机制 凋亡相关基

4、因,1、影响细胞凋亡的因素,2 凋亡的过程及机制,凋亡诱导因素,死亡信号,巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞,细胞凋亡信号转导的一般特征： 信号转导系统具有多样性 细胞凋亡与细胞增殖、分化过程中的信号转导系统存在部分共同的通道 细胞内同一信号激活的多条途径存在互通的交叉点,凋亡的起始阶段： 膜受体（死亡受体）途径 线粒体途径,死亡受体（death receptor, DR） 肿瘤坏死因子受体超家族成员，跨膜蛋白，与相应配体结合传递细胞信号 Fas(CD95), TNFR1,（1）死亡受体途径 （death receptor pathway）,参与死亡受体信号转导的接头蛋白： 死亡结构域（ death d

5、omain, DD）蛋白 FADD：Fas相关死亡结构域 FasL + Fas +FADD 细胞凋亡,FADD的C端与Fas胞内段结合， N端与caspase8酶原交联,（2）线粒体途径,线粒体释放细胞色素C 细胞凋亡 PT孔开放线粒体跨膜电位，细胞色素C释放 促凋亡蛋白Bax促PT孔开放 抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl抑制PT孔开放,细胞色素C + Apaf-1 + caspase9前体凋亡体 召集并激活caspase3 细胞凋亡 Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子,线粒体途径 （ mitochondrial pathway）,凋亡的执行 Caspase依赖的细胞凋亡(Cysteine，a

6、spartic acid，protease),Caspase 的特点： 以酶原的形式存在，激活后水解形成大小 两个亚单位,大小亚基结合（二聚体） caspase激活（四聚体）, Caspase激活形式 Pro-caspase： NH2末端结构域 、20KD亚基、 10KD亚基,剪切,Caspase家族的分类 凋亡启动亚类Caspase蛋白酶： Caspase8， Caspase 9，Caspase10 在凋亡启动阶段发挥作用 凋亡效应亚类Caspase蛋白酶： Caspase3， Caspase6， Caspase7 在凋亡执行阶段发挥作用,水解粘附分子，使细胞与周围组织脱离 活化DNA酶，使

7、DNA片段化 水解DNA多聚酶，抑制核酸合成 降解Rb蛋白，使细胞周期停滞 剪切细胞内结构蛋白,Caspase的作用,Pro-caspase-9,caspase-9,Effector caspase,Caspase-3,Pro-caspase-3,正常情况下， CAD (caspase-activated DNase)与抑制物ICAD-DFF-45结合，存在于胞质中，无活性 Caspase活化后降解ICAD， CAD激活并入核降解DNA使其片段化 活化的CAD 在核小体的连接区将DNA切断，形成约200bp整倍数的核酸片段,Caspase非依赖的细胞凋亡 （Caspase-independen

8、t apoptosis） 凋亡诱导因子（AIF） 线粒体蛋白AIF释放到胞质内与抑制凋亡的因 子结合，从而促发凋亡 钙超载,钙超载引起凋亡机制,胞浆Ca2+ ,激活核转录因子，加速凋亡相关基因的转录 在ATP参与下暴露出核小体间连接区，有利于核酸内切酶切割DNA 激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链 激活谷氨酰胺转移酶，使细胞骨架分解凋亡小体,细胞凋亡,3、细胞凋亡的调控基因 （Regulated mechanism of apoptosis）,Bcl-2基因 （B cell lymphoma/leukemia-2） 广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种瘤细胞

9、 Bcl-2家族已发现15个成员，可分为3个亚族： Bcl-2亚家族：抑制细胞凋亡 Bax亚家族：促进细胞凋亡 BH3亚家族：促进细胞凋亡,Bcl-2蛋白抑制凋亡的机制： 抑制线粒体PT孔开放，Cyt.c 、AIF释放 结合和灭活Apaf-1，阻断caspase-9活化 特异性结合细胞色素C 维持细胞钙稳态,促凋亡基因（Bax, Bak, Bid, Bim, Bad) 其蛋白与抗凋亡蛋白相互作用，使抗凋亡蛋白抑制凋亡的作用丧失，引发线粒体膜崩解,p53促凋亡机制： - 与Bcl-2基因相互作用，下调 Bcl-2的表达 - 诱导凋亡的相关蛋白（Bax等）表达，并触发细胞色素C释放和caspase

10、活化 - 诱导死亡受体Fas表达,凋亡与疾病,（Diseases associated to apoptosis）,（一）细胞凋亡不足（Apoptosis inhibition） 1. 肿瘤（Tumor）, bcl-2基因过表达,细胞生理性死亡减少 肿瘤发生 85%滤泡状和20%弥漫性B细胞淋巴瘤 染色体 t（14;18）易位 IgH基因与bcl-2基因拼接 bcl-2基因活化 细胞凋亡速率 肿瘤发生 （乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、胶质瘤等也存在Bcl-2高表达）, Rb 和p53基因缺失或突变 细胞细胞周期异常、凋亡率 细胞无限制生长 肿瘤发生,病毒的癌基因 HBV编码的HBX是Caspas

11、e-3的强效抑制物，与肝癌发生密切相关,2自身免疫病（Autoimmune diseases） 针对自身抗原的B或T免疫细胞未被及时清除，机体产生针对自身抗原的体液免疫和细胞免疫，导致器官组织损伤。,（二）细胞凋亡过度（Apoptosis excess） 1.心肌缺血与缺血-再灌注损伤 特点 缺血早期以凋亡为主，晚期以细胞坏死为主。 在梗死灶的中心以坏死为主，梗死灶周边以凋亡为主； 轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主； 机制 氧化应激 Fas通路 p53基因转录增加,2.病毒性肝炎 HCV感染肝细胞 病毒刺激CTL,高表达Fas 高表达FasL,CTL致大量肝细胞凋亡，爆发性肝功能衰竭,

12、HBV、 HCV感染 刺激免疫细胞产生TNF- 肝细胞凋亡或坏死,细胞凋亡在疾病防治中的意义 合理利用凋亡相关因素 1.诱导靶细胞凋亡 放疗、化疗 高热、高温 2.减少细胞凋亡 ： NGF、促生长因子、抗氧化剂,抑制Bcl-2抗凋亡作用 增强促凋亡基因作用 增强P53促凋亡作用, 干预凋亡信号转导 调节凋亡相关基因 控制凋亡相关酶学机制 防止线粒体跨膜电位的下降,细胞凋亡的检测 早期检测,1、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 2、线粒体膜势能（mt）的检测 3、细胞色素C的定位检测 4、Caspase-3活性的检测 5、细胞内氧化还原状态改变的检测 6、凋亡相关蛋白TFAR19的表

13、达和细胞定位分析,晚期检测,1、DNA片断化检测 2、TUNEL法 3、细胞凋亡的形态学检测,磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）,Phosphatidylserine(PS) 正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期从细胞膜的内侧翻转到膜表面 Annexin-V： Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）标记后作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。,Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV + PI,流式细胞术检测：,线

14、粒体膜势能（mt）的检测,线粒体荧光染料：Rhodamine 123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电位的增高或降低。,Caspase3 活性检测,凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达 和细胞定位分析 凋亡早期TFAR19表达并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。 利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针进行TFAR19蛋白的细胞定位分析,Double staining analysis of nuclear localization of TFAR19 in K562 and HeLa cells treated with VP16,DNA片段化分析,细胞凋亡时染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。,TUNEL法,TUNEL法,细胞凋亡的形态学检测,光学显微镜和倒置显微镜 未染色细胞：凋亡细胞V变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，晚期可见凋亡小体。 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变