第八章 基因芯片技术及应用.ppt

1、第八章：基因芯片技术及其应用。1.概述：随着人类基因组测序计划的逐步实施和分子生物学相关学科的快速发展，越来越多的动物、植物和微生物的基因组序列被确定下来。基因库数据库中有300万个序列，总共超过22亿个碱基对，包括19种不同生物的完整序列和近9 000个具有已知或推测功能的人类基因序列。基因序列数据库正以前所未有的速度增长。然而，如何充分利用新的序列信息资源，如何研究如此多基因的生物信息及其在生命过程中的作用，已经成为生命科学家的共同课题。已有的方法，如Northern印迹、核糖核酸酶保护实验、S1核酸酶分析、噬斑杂交和窄行印迹，不能提供足够的通量来有效利用新的基因组学资源。因此，有必要开发

2、高通量或平行监测基因表达的新方法。正是在这种背景下，基因芯片技术应运而生。早在20世纪80年代初，就有人设想利用计算机半导体技术生产基因芯片来分析和检测人类基因的大量遗传信息。然而，直到1994年，皮斯等人创造了光导原位合成高密度微寡核苷酸阵列的制造技术(ODTA)，这一想法才逐渐成为现实。因此，可以说光导向ODTA化学合成为基因芯片技术奠定了基础。目前，全球有十多家公司从事基因芯片的研发，并有更多的成型产品和设备问世。这些公司主要由美国的Affymetrix公司代表。图片来自怡来基因网络： http:/。1997年3月，美国财富杂志聚焦于基因芯片技术未来产业化的前景。基因芯片的定义，也称DN

3、A芯片，是指以许多特定的寡核苷酸片段或基因片段为探针，有规则地排列固定在支持物上，然后根据碱基配对的原理与待测标记样品的基因进行杂交，然后通过激光共聚焦荧光检测系统进行扫描，配合计算机系统对每个探针上的荧光信号进行比较检测，从而快速获得所需的信息。3。基因芯片的相关技术和进展，靶基因的制备、杂交和检测，基因芯片设计的杂交图像分析，1。基因芯片的主要类型，根据基因芯片的不同分类方法、主要类型和简要特点，可以分为不同的类型。基因芯片的制备基因芯片的本质是一个高度集成的寡核苷酸阵列。制造基因芯片首先要解决的技术问题是如何在芯片基底上定位和合成高密度核酸探针。原位合成直接使用芯片上四个核苷酸合成所需的

4、探针合成样品来定位芯片上合成的探针。基因芯片制备的两种基本方法，原位平版印刷合成，是由美国的Affymetrix公司开发的，它们用光保护基团修饰玻璃基底上的活性羟基，该基团可以被一定波长的光激活和去保护。根据所要制造的阵列的需要。将掩模(M1)覆盖在改性的基底上，并且用光照射暴露区域中的基底表面，以去除保护基团，从而形成活性羟基(1-2)。在该步骤中，引入其5个末端被X基团保护且其3个末端被活化的单核苷酸dNTP，使得dNTP的3个末端与底物上的活性羟基缩合，并且未结合的dNTP(3)被洗掉。更换M2掩模，重复步骤1-2，直到合成出所需的探针阵列(4-6)。通过使用各种掩模，可以用更少的合成步

5、骤生产高密度阵列，并且探针的数量在合成周期中呈指数增长。一个含有10个核苷酸的寡核苷酸可以通过4n个化学步骤合成4n种可能的结构。例如，对于一个完整的10个核苷酸，在32个化学步骤后，可以在8小时内合成65，536个(即216个)探针。图片来自布朗实验室/pbrown/,原位喷射印刷合成，原位喷射印刷合成芯片的原理类似于喷墨印刷，但有几个芯片喷射印刷头和墨盒，墨盒包含四个基地和其他液体采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要专门制备的化学试剂。BioDot:的图片，分子印记多印记合成方法，根据所需的微阵列，设计具有凹凸的微印记，然后根据

6、预先设计在制备的印记上涂覆相应的单核苷酸。按照设计顺序，将不同的微型印章逐一印刷在同一基底上，得到256256阵列高密度基因芯片。图片来源于逸来基因网络： http:/www.el-，256 * 256分子印章阵列显微照片(0.18%)，高密度DNA阵列显微照片(0.16%)，高密度DNA阵列荧光杂交图(0.09%)，图片来源于逸来基因网络3360 http:/www.el-。通过提高集成度和降低单个芯片的成本，可以组装大量(104-106)个生物分子探针，信息量大，效率高，特别适合收集基因信息。结合微机械技术，可以将生物样品的预处理、遗传物质的提取和扩增、杂交后的信息检测集成在一起，制备出用

7、于微小物体的微芯片。优势和特点：高密度、高分辨率、高精度、高合成产率、高一致性、工艺优化、批量印刷、合成点样和合成点样技术是基因芯片仍处于实验研究阶段时唯一的芯片制造方法，而这种方法曾被原位合成技术所掩盖。随着原位合成技术缺点的暴露和自动化技术的进步，合成点样技术重新出现。在这种方法中，合成的探针、基因或基因组被一个特定的高速定位机器人直接定位在芯片上。目前，除了像Affymetrix这样研究和生产基因芯片的几家大公司使用原位合成外，其他中小型公司和实验室仍普遍使用合成斑点法。微机械点样法、化学喷涂法、微机械点样法，由沙隆和布朗于1995年开发。美国Synteni公司最终开发了商业仪器，并完成

8、了商业化。使用取样针通过毛细作用将生物化学物质转移到固体基质表面(取样针与基质表面接触)。第一轮操作后，清洁取样针，以便进行下一轮操作。机器人控制系统可以使其实现自动化生产。方法和步骤，化学喷雾法，它是通过压电和其他推动方法将生化成分从微型喷嘴转移到固体表面的先进方法。这项技术由几个中心开发，如Incyte制药公司(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托)和Protogene公司(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托)。用与压电接口(方形)相连的微型喷嘴将生化物质喷射到基底上，通过电流控制精确控制样品体积。第一轮后，清洁喷嘴并进行下一步。方法和步骤、芯片制造技术的发展、Bains等人在1980年进行的将预先合成的短

9、DNA片段固定在固体支持物上的杂交测序实验是基因芯片的原始模型，因此合成点样是基因芯片制造的原始方法。Affymetrix公司开发的光导ODTA合成照相平版印刷术将基因芯片引入了工业生产阶段。集样品处理、芯片杂交和信号检测于一体的所谓“微型实验室”，已逐渐成为基因芯片发展的新趋势。在这方面，以下技术比较成功：电子芯片三维芯片、流通芯片应时共振芯片、电子芯片。衬底是带正电荷的硅片。热氧化后，硅片制成1mm2阵列，每个阵列包含多个微电极，通过氮化硅沉积和刻蚀在每个电极上制备样品池。电极上覆盖有抗生物素蛋白链的琼脂糖，预先合成的生物素标记探针在电场作用下可以与特定电极结合。Nanogen网站上的图片

10、：是由美国Nanogen公司首先开发的，中国的清华大学和复旦大学也在开发中。最大的特点：杂交速度快，可以大大缩短分析时间。最大的缺点一种三维芯片，在基底上有大量微小的聚乙烯酰胺凝胶条，每个凝胶条都可以进行DNA分析。首先，将已知化合物加入到凝胶条中，通过3厘米长的微玻璃毛细管将待测样品加入到凝胶条中。三维凝胶条可以添加更多的已知物质，提高灵敏度。扩增和检测可以在芯片上同时进行。但是这项技术不仅可以用于基因芯片，也可以用于蛋白质芯片。由美国的帕卡德、摩托罗拉和阿尔贡国家实验室与俄罗斯的恩格尔哈特分子生物学研究所合作开发。应用优势，流通芯片，在芯片衬底上制作光栅微通道，将预先设计合成的特异性寡核苷

11、酸探针结合到芯片上微通道的特定区域。picute来自英国msts suim MIT会议： http:/www.cmf.rl.ac.uk/presentations/,从待测样品中分离出脱氧核糖核酸或核糖核酸，并用荧光标记。标记的靶核酸样品流过芯片，固定在芯片微通道中的寡核苷酸探针捕获互补的靶核酸。来自英国msts suim MIT会议：的picutre具有高灵敏度的特点。由于寡核苷酸吸附表面的增加，流通芯片可以监测稀有基因表达的变化。速度快，微通道加速了杂交反应，减少了每次检测所需的时间。由于采用特殊的共价化学技术将寡核苷酸吸附在微通道中，使得每个流通芯片可以重复使用，降低了成本，降低了成本。

12、基因逻辑正在发展。3.靶基因样品的制备，需要通过常规方法从细胞和组织中提取模板分子，扩增并标记模板。目标基因样品的制备方法将根据基因芯片的类型和研究对象(如基因、脱氧核糖核酸等)而定。)。3.1靶基因和核酸样品的制备是基因芯片分析的必要步骤，传统的化学提取方法耗时，不能满足基因芯片快速高效的要求。因此，人们发明了结合芯片的核酸提取方法。芯片微滤，即生物电子芯片法，是由宾夕法尼亚大学研究小组设计的用于分离人类白细胞的核酸样品制备方法。微滤芯片是通过在硅片上雕刻几个不同形状的微米级过滤微通道，然后在硅片上加一层玻璃盖板制成的。发展经历了垂直的“Z”形结构、垂直的条形梳形结构，最后发展到水平的坝式结

13、构。芯片微滤是一种为介电泳设计的细胞分离方法，目的是从血清、水样或其他液体样品中分离不同的癌细胞、细菌或病毒。通过在硅片上制作一系列不同排列的金属电极，并对这些电极施加高频电场，甚至可以在不同的电池中感应出电极。反过来，均匀电极的出现使细胞承受正介电力或负介电力，从而使细胞可以从各种液体样品中分离出来。美国Nanogen公司在微滤芯片的电极上施加一系列高压脉冲，对从电极上分离的大肠杆菌细胞进行电子细胞裂解，获得大肠杆菌细胞中的各种核糖核酸和脱氧核糖核酸。图片来自Nanogene网站：3.2靶基因的扩增和标记，主要采用荧光分子标记：在扩增过程中增加了含有荧光标记(至少一种是荧光标记)的常规标记d

14、NTP。末端标记直接标记引物上的荧光。4。目标基因的杂交及其信号检测、荧光显影法、质谱法、化学发光法、光纤法、压电应时共振法、4.1荧光显影法，用荧光素标记扩增的核酸样品，将荧光素标记的核酸样品与芯片杂交，洗去未杂交的标记样品，用荧光显微镜或荧光扫描仪扫描芯片以收集每个点的荧光强度，并用计算机进行分析和比较。激光共聚焦荧光检测系统是目前应用最广泛的荧光检测系统。芯片倒置在含有待检测核酸、ch探针当激光从芯片背面聚焦在芯片与目标DNA的接触面上时，与待检测核酸杂交的位点被激发发出荧光，荧光信号通过棱镜后聚焦在空间共焦孔径上，并通过孔径被检测器捕获。虽然激光也将激发储器中未与芯片杂交的标记的目标核

15、酸，但是荧光被针孔阻挡并且不能到达检测器，因为它们不在共焦针孔的焦平面中。利用激光共聚焦荧光检测系统可以在几分钟内获得二维杂交模式，还可以通过改变温度获得杂交的热力学信息。沃森-克里克配对双链错配碱基的双链荧光强度具有完全正常的热力学稳定性(5-35%)，荧光扫描仪简介，CCD(电荷耦合器件)光电倍增管光电倍增管(光电倍增管)，图片来自Yilai Gene Network : http:/www . El-，CCD成像技术：主要用于检测中高密度基因芯片，商业扫描仪公司，基因组解决方案，帕卡德，GSI，比彻仪器，分子动力学遗传微系统，轴突仪器，4.2化学发光法，化学发光的基本原理相似化学发光比荧

16、光更灵敏。4.3光纤法，将合成的三聚氯氰激活的寡核苷酸探针固定在直径为200米的光纤末端，然后将固定有不同探针的光纤按特定位置组合成束，形成微阵列传感装置，即光纤DNA生物传感器微阵列。探针端可以延伸到样品溶液中，杂交的荧光信号被耦合到光纤另一端的电荷耦合器件照相机接收。整个分析操作可以在5分钟内完成。4.4光纤法，光纤DNA生物传感器微阵列的探针敏感膜可以重复使用，因此可以降低成本。这种传感器与微阵列相结合的方法特别适用于杂交分析不方便操作的环境和没有激光共聚焦显微镜等昂贵设备的实验室(如临床检测实验室)，对基因芯片的推广应用具有重要意义。4.5压电应时共振法，传感装置采用压电应时共振晶体，目前正在开发中，4.6压电应时共振法，应时共振DNA生物传感器微阵列比光纤DNA生物传感器微阵列有更多的优点，而应时共振传感器被称为微量天平，具有高灵敏度(理论上可以达到fg水平)，这有望省略杂交前的扩增步骤。应时共振传感器的响应机制是“压电效应”，这意味着它对质量敏感，因此不需要标记探针或靶核酸。1998年底，美国科学进步协会将基因芯片列为1998年自然科学领域十大进步之一。1.核酸序列分析、杂交测序技术(