第六章 氨基酸发酵生产工艺学.ppt

1、第六章 氨基酸发酵工艺,氨基酸是构成蛋白成分 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。,氨基酸, 碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。,氨基酸的用途,1.食品工业： 强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中) 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。,2.饲料工业： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 3.医药工业： 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。

2、 4.化学工业：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。,氨基酸的生产方法,发酵法： 直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。,酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。,生产氨基酸的大国为日本和德国。 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的

3、氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。,国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。 在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,1991年销售量为二千万瓶,1996年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。 据专家估计,到2000年,世界氨基酸产值可达45亿美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值可达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。,氨基酸发酵生产发展

4、的历史回顾,所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主要原料的培养基中培养微生物,积累特定的氨基酸。 这些方法成立的一个重要原因是使用选育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。,谷氨酸的合成途径,Glucose的酵解，EMP Glucose的有氧氧化，HMP 丙酮酸的有氧氧化，TCA循环 乙醛酸循环途径，DCA循环 CO2固定反应 -KGA的还原氨基化,C6H12O6 HMP 3-磷酸甘油醛 乳酸 丙 酮 酸 乙酰辅酶A CO2 草酰乙酸 柠 檬 酸 苹果酸 异柠檬酸 延胡索酸 琥珀酸 NADPH KGA NADPH NH4+ 谷氨酸,谷氨酸合成的内在因素,KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失 这是菌体生成并积累

5、KGA的关键，KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，KGA才得以积累。,GA产生菌体内的NADPH的在氧化能力欠缺或丧失 NADPH是KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联 的。 由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制KGA的脱羧氧化有一定的意义。,产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠

6、檬酸裂解酶。 该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。关于该酶的酶活性的调节后述。,菌体有强烈的L谷氨酸脱氢酶活性 KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADP L谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强 该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联,GA 生物合成的最理想途径,GA 合成所必需的条件的基础上（封闭乙醛酸循环）体系不存在CO2固定反应,3/2Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 + 丙酮酸 CO2 乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A

7、 柠檬酸（DCA循环封闭） 谷氨酸,3/2 C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4 + 4 CO2 产率：147 /（180*3/2） = 54.4%,GA 合成所必需的条件的基础上（封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应,Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 CO2 CO2 草酰乙酸 （草酰乙酸羧化酶） 乙酰辅酶A + C4二羧酸 苹果酸 （苹果酸激酶） 柠檬酸（DCA循环封闭） 谷氨酸,C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4 + CO2 产率：147 / 180 = 81.7%,GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径： 磷酸丙酮酸羧化酶的作用下 磷酸丙酮酸 + CO

8、2 + GTP = 草酰乙酸 + GDP 苹果酸合成酶的作用下 丙酮酸 + CO2 +NADH = 苹果酸 + NAD 需要Mn+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+,提高GA的潜力仍然是很大的，具体表现在： 强化CO2固定反应，具体措施：Mn+ ，生物素 控制溶氧浓度是非常重要的 低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化 高的溶氧浓度，则NADPH 有被氧化的可能,生物素对GA发酵的影响,生物素对糖代谢的影响 可以通过控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭 生物素对氮代谢的影响 GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限

9、制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。,对菌体细胞膜通透性的影响 培养基中生物素限量时，胞内AA 92% 胞外 培养基中生物素丰富时，胞内AA 12% 胞外,GA发酵的外在因素,供氧浓度 过量：NADPH的再氧化能力会加强，使KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA 的生成。 供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。,NH4+浓度 影响到发酵液的pH值 与产物的形成有关： 过低，不利于KGA的还原氨基化 过高，产生谷氨酰胺 NH4+的供给方式： 液氨 流加尿素,磷酸盐 过量：促进EMP途径，打破EMP与

10、TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸 产生并积累Val，,Glucose 丙酮酸 + 丙酮酸 （焦磷酸硫胺素，TPP） 活性乙醛 乙酰乳酸 Val,Val 可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止 消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率 发酵液中的Val存在，严重的影响GA 的结晶、提出。,菌株的育种,从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件. 在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。 随着重组DNA技术的发展,接合、转导、转染、细胞融合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方法构建生产菌株的尝试。 随着载体、受体系统的构建

11、及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。 苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生产。,用野生株的方法,这是从自然界获得的分离菌株进行发酵生产的一种方法。 典型的例子就是谷氨酸发酵。 改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵,用营养缺陷变异株的方法,这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停止，不让最终产物起控制作用。 这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。,氨基酸发酵的代谢控制,控制发酵的条件 控制细

12、胞渗透性 控制旁路代谢 降低反馈作用物的浓度 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用 促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成,控制发酵的条件,专性需氧菌，控制环境条件可改变代谢途径和产物。,控制细胞渗透性,生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。 青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞面内外的渗透压而泄露出来。,控制旁路代谢,降低反馈作用物的浓度,利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。,限制精氨酸的浓度可解除反馈抑制，实现鸟氨酸的生物合成。,促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成,ATP的积累可促进氨基酸的生物合成,氨基酸发酵的工艺控制,培养基 pH 温度 氧,培养

13、基,1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃 碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。 菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类,2、氮源：铵盐、尿素、氨水； 同时调整pH值。 营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液。 需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。 尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。可分批流加。 氨水用pH自动控制连续流加,3、合适C/N 氮源用于调整pH。 合成菌体 生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的C/N高。,4、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。 5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢

14、酶活力。 6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。,7、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。 8、锰：是许多酶的激活剂。 9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。 10、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。,生长因子：生物素 作用：影响细胞膜透性和代谢途径。 浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。过少菌体生长缓慢，发酵周期长。 与其它培养条件的关系：氧供给不足，生物素过量时，发酵向其它途径转化。 种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜为来源。,pH对氨基酸发酵的影响及其控制,作用机理：主要影响酶的活性和菌的

15、代谢。 控制pH方法：流加尿素和氨水 流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。,控制： （1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高 （2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。 （3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。 （4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。,温度对氨基酸发酵的影响及其控制,菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。 菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖耗慢，周期长，酸产量低。 采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长温度，减少风量等

16、，促进菌体生长。,氧对氨基酸发酵的影响及其控制,要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA循环有关。 适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量最大。 供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵,谷氨酸生产工艺,工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。 1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。 目前世界产谷氨酸钠30吨/年，占氨基酸总量的2/3。 我国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。,产生菌株特点： 革兰氏阳性 不形成芽胞 没有鞭毛

17、，不能运动 需要生物素作为生长因子 在通气条件下才能产生谷氨酸。,谷氨酸生物合成机理： 由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性氨化作用而得到。,一、淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解 1、调浆：干淀粉用水调成10-11Bx的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8至pH1.5。 2、糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80下中和。 3、中和：烧碱中和，至pH4.0-5.0 4、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6-0.8，在70度及酸性条件下搅拌后过滤。,酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用 大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行

18、液化，85 30min，加糖化酶60 糖化24h，过滤后可供配制培养基。,糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。 预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加中青霉素。,二、菌种扩大培养 1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。 生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培养基，32培养18-24h。,2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷

19、酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。1000ml装200-250ml振荡，32 培养12h。 3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1，用水解糖代替葡萄糖，于32 进行通气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为108-109 /ml。,三、谷氨酸发酵,1、适应期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。 2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的

20、八字形。不产酸。12h。 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度30- 32,3、菌体生长停止期：谷氨酸合成。 措施：提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4。大量通气，控制温度34-37 。 4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。 发酵周期一般为30h。,谷氨酸发酵控制,（1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影响磷酯的合成。 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。 生物素过量，则发酵过程菌体大量繁

21、殖，不产或少产谷氨酸，你谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。,（2）种龄和种量的控制 一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。 种量为1。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，后期产酸量不高。 （3）pH。 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵慢，长菌不长酸。 谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2，转氨酶最适pH 7.2-7.4。在发酵中后期，保持pH不变。过高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。,（4）通风：不同种龄、种量，培养基成分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。 在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏，抑制菌体生长。 在发酵产酸阶段，需要大

22、量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，则大量积累a-酮戊二酸。,防止噬菌体和杂菌的污染 从空气过滤、培养基、设备、环境等环节严格把关。,四、谷氨酸的提取,1、等电点法：操作简单，收率60。周期长，占地面积大。,2、离子交换法：用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱，收集相应流分，再加盐酸结晶。,谷氨酸发酵研究新进展,继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或可在富含生物素的培养基中保持较高产酸水平。提高原料利用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。 生物工程新技术的应用：体外DNA重组的基因工程和原生质体融合技术和固定化细胞技术使产量提高近1倍。 改进发酵工艺：开拓原料，

23、改进流加工艺，通过电子计算机控制发酵条件。,非糖质原料的谷氨酸发酵,醋酸发酵谷氨酸 机理：醋酸形成乙酰CoA，再进入TCA，因此凡能利用葡萄糖原料的菌种也可作为醋酸发酵谷氨酸的菌株。 以醋酸钠或醋酸铵与醋酸的混合液为原料，且浓度不超过4。发酵过程中也需流加以保持pH。,Lys的生物合成机制与代谢调节,一、行业简介 Lys是人体所必需的8种氨基酸之一 发酵法赖氨酸的生产最早起源于日本，我国80年代中期相继有赖氨酸的发酵生产厂家，山东海洋还有生产厂家。80年代赖氨酸食品曾经非常盛行 .,我国的Lys生产与国外的差距主要表现在： 菌种性能的差异，Lys 是菌体代谢过程中的中间性产物，但不是主链上的产

24、物，其生成机制很复杂，对菌种的要求很高，国内菌种的产酸水平为：3555g/L，转化率为：2025%。远低于国外的生产水平。 提出率较低。 生产规模较小。,二、赖氨酸的生物合成机制,赖氨酸生物合成途径有两条 以细菌类为主的一条合成途径 以酵母菌为主的一条合成途径,细菌类发酵与酵母菌发酵的比较,优点： 菌体体积较小，相对增殖所用的底物较少，产量高。 细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有几分钟，而酵母的增殖速度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。 细菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌，例如，GA的发酵；对于胞内

25、产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。,缺点： 细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物的结晶提出，或产物就是菌体或菌体内的胞内物），细菌比酵母菌难以分离。 细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。 细菌发酵易感染噬菌体,细菌赖氨酸发酵使用的菌种通常有两种类型,大肠杆菌中的Lys的生物合成与代谢调控：,Glucose EMP 丙酮酸 草酰乙酸 Asp (天冬氨酸激酶AK，同功酶) 天冬氨酸磷酸（asp-p） 天冬氨酸-半醛 （高丝氨酸脱氢酶 同功酶） 二羟吡啶羧酸 高丝氨酸（Hos）高丝氨酸脱氢酶 Lys

26、珀酰高丝氨酸 O-磷酸高丝氨酸 Met Thr,大肠杆菌赖氨酸代谢特点： 关键酶：天冬氨酸激酶是一个同功酶，分别受三个代谢产物的抑制，这三个终产物分别是：Lys、Met和Thr，只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp激酶的活性才能完全被抑制。 同功酶：催化同一反应，但其活性受不同代谢产物体调节的酶。,根据上述代谢特点，要使菌体合成并积累Lys，可以选育Hos-，这样的话，既可以解除天冬氨酸的代谢支路，使代谢流向Lys的方向进行，提高了从底物葡萄糖到产物的转化率；更重要的是由于Hos-，使得代谢过程中不可能产生过量的Met、Thr，尽管产生了大量的Lys，Lys可以抑制关键酶天冬氨酸激酶1，但是

27、天冬氨酸激酶2、3的活性由于Met、Thr的限量，并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸半醛，仍可以大量的生成，这就保证了Lys的生物合成途径的畅通无阻。,黄色短杆菌Lys生物合成的调控,Glucose EMP 丙酮酸 草酰乙酸 Asp (天冬氨酸激酶AK，变构酶) 天冬氨酸磷酸（asp-p） 天冬氨酸-半醛 （高丝氨酸脱氢酶变构酶） 二羟吡啶羧酸 高丝氨酸（Hos）高丝氨酸脱氢酶 Lys O-琥珀酰高丝氨酸 O-磷酸高丝氨酸 Met Thr,黄色短杆菌与大肠杆菌（E.coli）的区别： 天冬氨酸激酶（AK），在黄色短杆菌中是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys、Thr的协同反馈抑制， 协同反馈抑制，就是该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。 黄色短杆菌中，存在两个分支点的优先合成机制，即优先合成Hos，然后再优先合成Met，当Met过量时，阻遏：使代谢流向合成Thr的方向进行，当Thr过量时，反馈抑制：Asp-半醛 Hos所需要的酶的的活