LY∕T 3107-2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程

ICS65.020.20

B61

LY

中华人民共和国林业行业标准

LY/T3107—2019

柳树品种微卫星标记鉴别技术规程

TechnicalregulationforwillowvarietiesidentificationbySSRmarkers

（发布稿）

2019-10-23发布2020-04-01实施

国家林业和草原局发布

LY/T3107—2019

I

前言

本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。

本标准由全国林木种子标准化技术委员会（SAC/TC115）提出并归口。

本标准主要起草单位：南京林业大学。

本标准参加起草单位：江苏省林业科学研究院；山东省林业科学研究院。

本标准主要起草人：李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东。

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柳树品种微卫星标记鉴别技术规程

范围范围

本标准规定了以柳属(Salix)植物DNA为材料，利用微卫星标记(microsatellite)对国家和省审(认)定

的柳树品种进行分子鉴定的规范化操作技术。

本标准适用于附录A中所列柳树品种的鉴别。

2术语和定义术语和定义

2.1微卫星微卫星标记标记microsatellite

微卫星标记，又被称为短串联重复序列(shorttandemrepeats,STRs)或简单重复序列(simplesequence

repeats，简称SSR)，是指基因组中由2～6个核苷酸组成的DNA串联重复序列。

2.2基因型频率基因型频率genotypefrequency

基因型频率指不同基因型在全部个体中所占的比率，全部基因型频率的总和为1或100%。

3操作程序操作程序

3.1取样取样和保存和保存

取柳树幼嫩叶片5片～10片，用干燥硅胶密封保存，用于DNA提取。

3.2DNA提取所需试剂提取所需试剂

a)1MTris：称取12.11gTris溶解到80mL超纯水中，调节pH=8.0，定容到100mL。

b)0.5MEDTA：称取18.61gEDTA溶解到80mL超纯水中，调节pH=8.0，定容到100mL。

c)5M氯化钠：称取23.38g氯化钠溶解到80mL超纯水中，定容到100mL。

d)5M醋酸钾：称取25.54g醋酸钾，200mL超纯水溶解后定容到250mL。

e)2%SDS：称取1.0g十二烷基硫酸钠(SDS)，40mL超纯水溶解后定容到50mL。

f)10%CTAB：称取10gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶解到80mL超纯水中，定容到100mL。

g)氯仿异戊醇：240mL氯仿，10mL异戊醇混合。

h)70%乙醇：70mL乙醇，加入30mL超纯水。

i)CTAB裂解液：1mL1MTris(pH=8.0)，4mL0.5MEDTA(pH=8.0)，28mL5M氯化钠，10mL10%

CTAB，5g聚乙烯吡咯烷酮，定容到100mL。

j)TBE缓冲液(10×)：称取108gTris碱和55g硼酸，加入40mL0.5MEDTA溶液（pH=8.0），用

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800mL双蒸水溶解后定容到1L，高温灭菌。

3.3DNA提取提取

DNA提取采用改良的CTAB法：

a)向2mL离心管中加入400µLCTAB裂解液，10µL的10mg/mLRnase，2µLβ-巯基乙醇。

b)取柳树叶片3-5片，放入研钵中加入液氮充分研磨，将研磨后的样品转入3.2.1的离心管中，

涡旋混匀后，65℃保温10min，再加入400µL2%SDS，涡旋混匀，65℃保温10min。

c)向3.2.2的离心管中加入130µL5M醋酸钾，涡旋混匀，将离心管插入冰中保存10min。

d)加入800µL氯仿异戊醇溶液(氯仿:异戊醇=24:1)，涡旋混匀后，12000rpm离心5min。

e)将上清液转移到新的2mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管8-10次，-20℃冻

存20min。

f)取出离心管，12000rpm离心5min，去除上清液。

g)加入500µL的70%乙醇，12000rpm离心2min，去除上清液。

h)重复3.2.7步骤一次。

i)加入500µL无水乙醇，12000rpm离心5min，去除上清液，离心管开盖室温放置30min。

j)加入100µLTE缓冲液，37℃保存5min，涡旋混匀获得DNA，将样品放在-80℃长期保存。

3.4DNA定量定量及质量检测及质量检测

a)取2µLDNA用微量核酸蛋白检测仪检测，直接读出DNA浓度和A260/280的比值。

b)根据上述测定浓度，取200ngDNA，加入2µL溴酚蓝，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，加入5000

bpmarker作对照，稳压100V，电泳缓冲液为1×TBE，电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照。

c)根据微量核酸蛋白检测仪的定量结果，将样品稀释成20ng/µL，在-20℃下保存备用。

3.5目的片段目的片段PCR扩增扩增

3.5.116对SSR引物及序列见附录B。

3.5.2目的片段扩增反应体系为15µL，具体试剂用量见表1。

表表1PCR扩增扩增反应反应体系体系

试剂浓度所需体积(µL)

PCRbuffer10×PCRbuffer(Mg2+Plus)1.5

Taq酶5U/µL0.2

ForwardPrimer5mM1

ReverePrimer5mM1

DNA20ng/µL2

dNTP5mM0.3

dUTP250nM1

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3

H2O6.8

3.5.3PCR扩增反应

将配制的扩增体系加入到8连管或96孔PCR板中，盖上管盖后涡旋混匀，在3000rpm下离心5s，

放入PCR仪中扩增，扩增程序为：

1)94℃变性4min；

2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；

3)72℃延伸10min，15℃保存。

3.6目的片段检测目的片段检测

3.6.1PCR产物变性

PCR产物用双蒸水稀释10-15倍，取1µL稀释产物加入到9µL的Loadingbuffer(91%超纯甲酰胺，

9%内标Genescan500Rox)后混匀；在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min，迅速放冰上冷却。

3.6.2PCR扩增产物检测

PCR产物检测采用ABIPRISM3130xl分析系统。从数据采集软件中创建一个片段分析程序，选择

片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒类型。创建一个自动分析模板，填写分析样品名称，选择样品类

型、内标类型、分析方法等。将变性的产物转入96孔PCR板，盖上仪器自带的PCR板盖，放入仪器

中。在软件中将PCR板链接到仪器，点击开始进行基因型分型。

3.6.3PCR扩增产物条带分析

采用基因型分析软件打开基因型分型的结果，根据内参大小直接读出每个样品目的片段的大小。

4送检样品分析送检样品分析

送检样品分析程序为：

a)随机选取附录B.1中的一对SSR引物，对待检样品进行PCR扩增。

b)将待检样品扩增得到的条带和附录C.1-C.2中对应引物的标准谱带相比较。

c)如果所有扩增条带和附录C.1-C.2中对应引物某一品种的标准谱带完全相同，即判定为相同品

种；如果扩增条带和其中几个品种的条带完全相同，则增加一对引物进行检测，直至检测到唯

一匹配的品种。

d)如果待检样品所有扩增条带有一个以上位点与标准谱带不同，即判定为不同品种。

e)根据基因型频率判定所鉴定品种真实性的准确率，见附录D。

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附录附录A

（资料性附录）（资料性附录）

本标准本标准适用鉴定适用鉴定的的柳树柳树品种品种表表

表表A.1本标准本标准适用鉴定的柳树适用鉴定的柳树品种品种

序号品种中文名拉丁名

1苏柳172SalixjiangsuensisCL‘J172’

2苏柳485S.jiangsuensisCL‘485’

3苏柳52-2S.jiangsuensisCL‘52-2’

4苏柳795S.jiangsuensisCL‘J795’

5苏柳799S.jiangsuensisCL‘J799’

6苏柳J932S.jiangsuensisCL‘J932’

7簸杞柳JW9-6S.integra×S.suchowensis‘JW9-6’

8簸杞柳JW8-26S.suchowensis×S.integra‘JW8-26’

9“旱沙王”北沙柳S.psammophila‘Hanshawang’

10银芽柳J1037S.agyrobractealis‘J1037’

11银芽柳J1050S.agyrobractealis‘J1050’

12银芽柳J1055S.agyrobractealis‘J1055’

13银芽柳J887S.agyrobractealis‘J887’

14金丝垂柳J1010S.aureo-pendula‘J1010’

15金丝垂柳J1011S.aureo-pendula‘J1011’

16花叶柳S.integravar.‘HakuroNishiki’

17渤海柳1号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-1’

18渤海柳2号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-2’

19渤海柳3号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-3’

20渤海柳4号S.matsudanaKoidz‘Bohailiu-4’

21旱柳S.matsudanaKoidz

22沙柳S.psammophila

23黄柳S.gordejeviiChangetSkV.

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附录附录B

（规范性附录）（规范性附录）

柳树柳树品种鉴别品种鉴别16对对SSR引物引物序列序列

表表B.1柳树品种鉴别的柳树品种鉴别的16对对SSR引物引物

序号引物名称引物正向序列(5’-3’)引物反向序列(5’-3’)

1W254-1AACATTCTGCTTCTTCCTTTAACCTCCATTACCATCCATA

2W46-460AAGCAAGCAAAAGTCAAGAGAGTATGCCAAGCAAGAAGAA

3W64-41TCAGAGCCTGGTTCATAAACAAATGCCAGAGCTAAA

4W64-65GCATACTTGGGCGTTGATTGACTTGGGTTGGGTTTT

5W64-255GTCTGAACCCTCATCTATCTGGAATCCATAATACAC

6W64-272TCACTTGCCGCCCTTCTTTGACGCCGCTGTAACCAC

7W64-286AAAGAATACATTTTAGGTGGATTTCAAGGTTCAATCAAGTTA

8W64-293GCAAAAGCCAAAAGGAGAAACCAGCAGAGGAAAGTG

9W64-311AGAGCAAAGCACATTTCAATACATCTACTGCCACCC

10W253-12ATCAAATCACGCTAATCCAACAAGAAAGCAACATCG

11W253-17ATTGAATGGGCACTAACCGCACTTCCACCTACCTCC

12W253-38CCCACCAAAGCGTCTGTCCGAGTTGTTGGGCTGGAT

13W253-47TTATTGCTGGAAAGGTTGTTCGTGTCTTTAGGGTCT

14W-292-5AAAGAAGGCAAACAAAGCAAAACAGCGAAAGAAGCAAA

15W253-22GCCTCTGTTCCCATGACCTGAGGACTGGAGCGGATT

16W-265-23TGGGAGGAGTGTCAGAAGCTCCATAACAACCAGCAA

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附录附录C

（资料性附录）（资料性附录）

16对对引物鉴定引物鉴定柳树柳树品种指纹图谱品种指纹图谱表表

表表C.1引物引物W254-1、、W46-460、、W64-41、、W64-65、、W64-255、、W64-272、、W64-286和和W64-293鉴定柳树品种指纹图谱鉴定柳树品种指纹图谱表表

品种

引物

W254-1W46-460W64-41W64-65W64-255W64-272W64-286W64-293

苏柳172389457469155167251285222228244258223153220224253258277255264

苏柳485380390463251286277224224254258282243254

苏柳52-2390398465472155167170222221225188270254257

苏柳795343390457472155167275128228191226220224284255

苏柳799342390457472251285128222228244220223220224277255

苏柳J932343389457463155167212257128224224277282292255

簸杞柳JW9-6380398457472251285222220223188220270298257264

簸杞柳JW8-26398465167232319221225188267242254

“旱沙王”北沙柳343393456155167128235277381224220224270247257

银芽柳J1037401456465155167251319220223188222307319266

银芽柳J1050398456475155167228251220223188258262242266

银芽柳J1055401456465155167277361224188307319266

银芽柳J887380398459167222277221225188220270299239266

金丝垂柳J1010343393457463470155167275285128222235191226159220224284247257

金丝垂柳J1011343393457155167251285128222235223220224270285247257

花叶柳390398457167222319220223188220291243264

渤海柳1号343389457469155212228232257262224153200224277282255

渤海柳2号389459467155235361381368224200254258262243257

渤海柳3号390456465469155159167228236381224220254258277255264

渤海柳4号343393456469155167212228236381224200220224258277247257

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7

旱柳390459466167128166277381224256200258282245264278

沙柳379393395467212239257285162170228319218224222286294250257

黄柳381389159167212257128381224224251271277301241255

表表C.2引物引物W64-311、、W253-12、、W253-17、、W253-38、、W253-47、、W292-5、、W253-22和和W265-23鉴定柳树品种指纹图谱鉴定柳树品种指纹图谱表表

品种

引物

W64-311W253-12W253-17W253-38W253-47W292-5W253-22W265-23

苏柳172158176241255222232202213237242227174188287321349270288

苏柳485158176241191232202213234227231174179271289264288

苏柳52-2170241195235227237174176271289288293

苏柳795158183241255222213237225174179188253287321270288303

苏柳799158180241255222232213237225174188321270

苏柳J932158176196241199218232202213237242227231169174188321244263

簸杞柳JW9-6164170241204235227233174176253287288293

簸杞柳JW8-26180241194202240225237174321288293

“旱沙王”北沙柳176241255184222232202213237242227174188321349270288297

银芽柳J1037164243253189194240237243170174320357291

银芽柳J1050180243251189194240230237170174320357291

银芽柳J1055160164243251189240237243170174320357291

银芽柳J887160181241202240233170174321288297

金丝垂柳J1010176183241255222202213237242225174179188253287270

金丝垂柳J1011176183241255222202213237242225174179188253287270288

花叶柳164241204240233246174182321288293

渤海柳1号158183241251255188230213237227170174179188321270288297

渤海柳2号176183243251190220232202213237242227170174179321270288297

渤海柳3号176241255188211230202213237242227174188321270288297

渤海柳4号183241255188230213237227174188321270288297

LY/T3107—2019

8

旱柳158176203241189201232202213237242227174321288297

沙柳172203223243251198242227233174176307321267291

黄柳158180189241191232202213237242227174321288

LY/T3107—2019

9

附录附录D

（资料性附录）（资料性附录）

各引物鉴定各引物鉴定柳树柳树品种基因型频率品种基因型频率表表

表表D.1各引物鉴定柳树品种基因型频率表各引物鉴定柳树品种基因型频率表

序

号

品种名称

引物

16个位点

基因型相

同概率

W254-1W46-460W64-41W64-65W64-255W64-272W64-286W64-293W64-311W253-12W253-17W253-38W253-47W292-5W253-22W265-23

1苏柳1720.080.080.080.040.080.040.040.080.080.360.080.360.360.240.040.084.81E-17

2苏柳4850.040.040.040.040.080.080.040.040.080.360.080.040.080.040.080.042.47E-20

3苏柳52-20.080.040.280.020.040.040.360.040.080.040.120.080.161.17E-17

4苏柳7950.040.120.040.040.080.20.080.160.080.360.120.040.042.67E-17

5苏柳7990.040.120.080.040.160.040.360.040.440.081.18E-15

6苏柳J9320.080.040.040.040.320.080.040.160.040.360.040.360.080.040.440.049.80E-18

7簸杞柳JW9-60.080.120.080.040.20.040.360.080.080.061.20E-16

8簸杞柳JW8-260.120.040.160.040.040.120.360.040.280.040.120.440.161.93E-16

9‘旱沙王’北沙柳0.20.080.280.080.320.20.060.080.360.360.240.080.243.79E-13

10银芽柳J10370.080.080.280.040.240.040.080.080.080.040.120.280.061.94E-16

11银芽柳J10500.120.080.280.080.020.280.080.20.16