农药小分子与DNA作用光谱法

1、一 实验意义 农药的使用在给农业带来巨大经济效益的同时，其负面效应也日益突出，尤其是农药对食品和环境的污染，并通过生物富集和食物链的传递进入人体，可造成农药残留在人体内蓄积，进而引起各种组织器官发生病变，甚至致癌、致畸、致突变，农药残留问题已成为当今食品安全最主要的问题之一。DNA 是生物体内主要的遗传物质，也是化学物质作用于生物体早期阶段的一个重要的靶标。药物分子与DNA 之间的相互作用模式主要有嵌插结合、沟槽结合和静电结合，其中嵌插结合是形成DNA 加合物最主要的模式，DNA 加合物的形成一旦逃避生物自身的修复，就可成为致突变或致癌的最小因子而被认为是致肿瘤过程的一个重要起始阶段。事实证明

2、，在体内与DNA 发生作用的化学物质都能在一定程度上在体外与DNA 发生作用。具有选择性的沟槽结合和嵌插作用是药物分子与DNA 相互作用研究的重点1 。荧光分析法和吸收光谱法是一种最常用的分析方法，这方面的工作有更多的文献报道2。溴化乙锭(EB)是一种研究DNA的最灵敏的荧光探针之一，关于它们与DNA的键和特性已有详尽的报道，水溶液中EB的荧光量子产率小，当键合到DNA上后，其荧光强度增强，且其激发波长有明显的红移。EB已作为一种典型的平面嵌入剂，用来对比讨论各种荧光分子与DNA的作用方式。通过荧光光谱等研究农药小分子与DNA的相互作用，求得了结合常数，取得了相关信息，从分子水平上探讨了其作用

3、方式。二 研究现状及发展趋势2.1 研究现状相互作用分析的研究目前在国内外都是较为热门的课题，所采用的研究手段主要有：光谱分析、波谱分析、表面等离子体激元共振(SPR)、电化学分析拍j、亲和毛细管电泳分析72(ACE)、原子力显徽镜(AFM)法、量热法等仪器分析方法。其中的光谱法包括荧光分光光度法、紫外可见分光光度法、红外光谱法、圆二色光谱法、拉曼光谱法、x射线衍射等。汪佳蓉，张国文等1采用紫外- 可见光谱法、荧光光谱法并结合溴化乙锭(EB)荧光探针、黏度测定、盐效应、磷酸盐效应和KI 荧光猝灭实验，研究倍硫磷（有机磷杀虫剂）与小牛胸腺DNA 的相互作用。结果发现，DNA 对倍硫磷内源性荧光产

4、生强烈的猝灭作用。李来生2等采用阿霉素荧光探针研究水溶性对一二甲氨甲基一杯芳烃与小牛胸腺DNA相互作用。实验发现：DNA能猝灭阿霉素的荧光。杯幅1胺能与DNA的磷氧负离子强烈作用，并以嵌入与静电位点竞争混合模式影响DNA一阿霉素。宫霞3等利用荧光光谱方法，以溴化乙锭(EB)荧光探针研究家蝇幼虫抗菌肽MDL一1与大肠杆菌染色体DNA的相互作用，探讨其作用模式为沟槽式和嵌入式混合模式。并计算出其结合常数和成键位点数。郑朝华4等利用荧光光谱法，研究左氧氟沙星与DNA间的相互作用模式。小牛胸腺DNA对左氧氟沙星的荧光具有强烈的猝灭作用。经计算得出结合常数和结合位点数，并推断两者之间为沟槽作用模式。张勇

5、5等采用荧光光谱法，利用血卟呤及金属血卟啉对甲氧卞氨嘧啶的识别作用，建立起灵敏的血卟啉分析方法，并求得结合常数和结合位点数。2.2 发展趋势药物的荧光分析法6进展：常用的药物分析方法有重量分析法、滴定分析法、色谱分析法（包括柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、离子交换色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、固相微萃取、高效毛细管电泳等）、光化学分析法（包括红外和紫外 可见分光光度法、荧光光谱法、化学发光法、磷光分析法、原子吸收光谱法、质谱法、共振光散射等）、电化学分析法等 荧光法以其灵敏度高、选择性好、操作简便等优点受到分析工作者的青睐 将荧光光谱分析法应用于药物分析，已在药物有效成分分析鉴定、药物代

6、谢动力学研究、临床药理与药效分析等方面取得长足发展，并广泛应用于生化分析、生物医学、临床分析等领域的痕量分析。常规荧光分析法最早被应用于分析抗疟疾药物奎宁， 随着荧光分析法的发展，其应用范围日益扩大，被广泛用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等的分析，涉及合成药物、生物药物和天然药物， 由于自身具有发射荧光特性的物质相对较少，并且受到拉曼峰和散射光等背景的干扰，常规荧光分析法在药物分析中的应用受到限制， 为使荧光分析法的应用更加广泛，发展了各类荧光分析方法，如对不发荧光的物质可通过某类化学反应使其转变为适合测定的荧光物质，对荧光较弱的物质可采取荧光增敏分析法，近年来，还发展了各种新型荧光分析

7、技术，如激光诱导荧光法、同步荧光法、导数荧光法、荧光探针法、光化学荧光法、时间分辨荧光法、三维荧光法、偏振荧光法、荧光免疫测定法、荧光成像技术、荧光光纤传感器等， 这些技术的应用加速了各种新型荧光分析仪器的研制，使荧光分析不断朝着高效、痕量、微观和自动化方向发展。随着药学学科的发展，人们对药物分析的要求越来越高，因此必须运用和发展更适当的分析方法来满足药物分析的要求! 今后的发展方向是：探索并提出常规药物荧光分析新方法；与计算机技术紧密结合，研制出自动化程度高、获得和处理信息速度快的荧光分析仪器；发现和合成选择性优良的药物荧光试剂；与其他现代化分析仪器和方法联合使用，以更准确、更灵敏、更专一和

8、更低检测限获得药物及药物与生物大分子相互作用的有关信息。三 实验方案材料与方法3.1 试剂与仪器36-38%的浓盐酸（上海振兴化工厂）；Tris试剂（天津市远航化工二厂有限公司）；西维因浓度为200g/ml；鲭鱼精 DNA(北京惠泽奥公司产品)用少量纯水稀释，浓度利用=6600L/molcm 来确定，其浓度为7.510-5 mol/L，溶液保存于4的冰箱中备用； 用0.35mlHCl溶液和0.6057gTris试剂混合配成pH=7.4的Tris-HCl 缓冲溶液；2.19 10-2 mol/L 的KCl 溶液；试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。F-7000 型荧光光度计 ；T6 紫外-可见

9、分光光度计。3.2 方法3.2.1 紫外法在紫外比色皿中，分别加入3.0mlTris-HCl 缓冲溶液和30lDNA，3.0mlTris-HCl 缓冲溶液和30l西维因，3.0mlTris-HCl 缓冲溶液和30l西维因和30lDNA，在波长为200-400nm中，分别测定其光谱。3.2.2 直接荧光法在荧光比色皿中，加入3.0ml Tris-HCl 缓冲溶液和200l西维因溶液，混匀。扫描其荧光光谱后，再逐渐加入浓度为DNA 溶液(10l/ 次，共5次)，混合均匀，放置5min 后进行荧光光谱测定。3.2.3 盐效应 在荧光比色皿中，加入3.0ml Tris-HCl 缓冲溶液，100l西维因

10、溶液，50lDNA溶液，混匀。扫描其荧光光谱后，再逐渐加入KCl溶液(10l/ 次，共5次)，混合均匀，放置5mi n 后进行荧光光谱测定。四 结果与讨论4.1紫外法 由图可知，在pH 7.4 的Tris-HCl 缓冲条件下，测定了7.510-5 mol/L DNA 的紫外吸收曲线，西维因的紫外吸收曲线，西维因与DNA的混合物的紫外吸收曲线。发现DNA的紫外吸收曲线与DNA和西维因吸光度之和的曲线sum有明显的差别，说明西维因和DNA 之间发生了相互作用。图一 西维因，DNA和西维因-DNA的紫外吸收光谱4.2直接荧光法 由图2可知，在pH 7.4 Tris-HCl 缓冲溶液中，西维因具有较强

11、的内源荧光，随着DNA 加入浓度的增大，西维因的荧光强度有规律的猝灭，表明西维因与DNA 发生了相互作用，DNA 对西维因的荧光产生了猝灭效应。图二 DNA存在下西维因的荧光光谱4.3盐效应 加入KCl可知K+对西维因-DNA体系的影响，可判断是否为静电作用。如图3所示，在335.2nm处最高峰和最低峰差值为105.3，差值较大，说明K+对西维因-DNA体系的影响较大，即静电作用也是西维因与DNA间的重要作用方式之一。图3 KCl对西维因-DNA复合物的荧光影响4.4 结论 本实验运用紫外，荧光光谱法并结合盐效应等多种实验方法对西维因与DNA 的相互作用模式进行研究，推断出西维因与DNA以静电

12、方式进行结合，这一研究结果与动物实验(文献11)结果相一致。参考文献1汪佳蓉，张国文等.倍硫磷与DNA 相互作用的光谱法研究J，食品科学。2009年第30卷15期：78-81.2李来生，黄志兵，王宇晓等荧光光谱法研究对一二甲氨甲基一杯(83芳烃与DNA相互作用J光谱学与光谱分析，2004，24(11)：78813宫霞，施用晖，乐国伟荧光光谱分析家蝇幼虫抗菌肽与大肠杆菌染色体DNA作用机理J光谱学与光谱分析，2005，25(13)：4204234郑朝华，叶宝芬，杜迎翔等左氧氟沙星与小牛胸腺DNA相互作用的荧光光谱法研究(J中国医药工业杂志，2004，35(12)：7407435张勇，雷亚春，刘滇生血卟啉及金属血卟啉与甲氧卞氨嘧啶相互作用的荧光光谱研究J光谱实验室，2004，21(3)：6096126潘祖亭，关洪亮，原华平，李微，陈果, 荧光光谱法在药物分析中的应用J, 吉首大学学报（自然科学版）, 第26卷第3期, 2005年7月.7刘峥，夏之宁等。光谱法在分子之间相互作用研究中的应用J，激光杂志2001年第22卷,第9页。8廖见培，黄杉生， DNA与小分子药物相互作用研究进展J，化学传感器第25卷第l期 ,2 O 0 5年3月.9刘炜, 毕和平,