无菌检查方法学验证实验08年5月.ppt

1、无菌检查法及中国药典2005年版无菌检查法中方法验证试验,2005版 中国药典 张春华,一无菌检查法,1.基本定义 无菌检查是检查要求无菌的药品.医疗器具.原料.辅料.以及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。 符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。,2需进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围,各种注射剂 眼用及外伤用制剂 植入剂 可吸收的止血剂 外用敷料、器材,3环境要求,环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域 一般要求 1826 4565 例行消毒处理 洁净度检查,4仪器及用具,无菌室内常备器具 恒温培养箱及生化培养箱 离心机，显微

2、镜，高压蒸汽灭菌器，恒温烤箱，开放或全封闭过滤系统等 玻璃器皿 无菌衣，裤，帽，口罩 除菌滤器及滤膜,5培养基,一般采用商品脱水培养基 洁净玻璃器皿 纯水 培养基的pH应符合规定 分装好的培养基及时密封后必须 在配制当天（2小时内最佳）进行灭 菌处理 培养基的储存:225、避光环 境，可保存三周左右,培养基的装量 培养基的适用性检查 培养基的无菌性检查 培养基的灵敏度检查,培养基的灵敏度检查 硫乙12ml，9支，4株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支），另1支培养基空白对照。培养3d(原5天)。 改良马丁9ml，5支，2株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支），另1支培养基空白对

3、照。培养5d。 结果判定 空白管培养基无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判灵敏度检查合格。 （原3支管有2管生长，合格。）,6菌种及菌液制备,菌种的保藏和传代 甘油冷冻管保藏法 斜面低温保藏法 菌种 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26003 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10104 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64941 白色念珠菌(Candida albicans) CMCC(F) 98001 黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(

4、F) 98003,菌液制备 一般当日使用 金葡铜绿的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，3035培养1824h 黑曲霉菌接种至改良马丁琼脂斜面培养基中， 2025培养57d,检验方法必须验证 薄膜过滤法验证试验 直接接种法验证试验 判断,二方法验证试验,1.薄膜过滤法 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100 cfu的试验菌。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。取一支装有同体积培养基的容器，加入等量的试验菌，作为阳性对照，按规定温度培养35天。各试验菌同法操作。,2.直接接种法 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8支，分别接入金黄色

5、葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液1ml(含菌小于100 cfu)各两管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1ml(含菌小于100 cfu)各两管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，按规定的温度培养35天。,与阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量；增加培养基的用量；使用中和剂如-内酰胺酶、对氨基苯甲酸、聚山梨

6、脂80等；更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行验证试验。 验证试验可与供试品的无菌检查同时进行。,3.阳性对照 应根据供试品的特性选择相应的 阳性对照菌： 无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌 抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌； 抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌； 抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。,3.1.阳性对照试验的菌液制备 同培养基灵敏度检查（大肠埃希菌的菌液制备同培养基的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌），如菌量为小于100cfu， 供试品用量 同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量（见药典附录表2、表3）。 阳性对照管培养4

7、872小时应生长良好。,3.2.阴性对照 每次无菌检查所用的溶剂、稀释剂和冲洗剂同法操作，作为阴性对照。 阴性对照不得有菌生长。,(二)检查法 有直接接种法和薄膜过滤法。 1.薄膜过滤法 强调了要“优先采用封闭式薄膜过滤器，也可用一般薄膜过滤器。” 无菌检查用的滤膜孔径为0.45m与直径为50mm。,根据供试品及溶剂的特性选择滤膜的材质。如抑菌性供试品采用具有疏水性边缘及低吸附性的滤膜。 滤器及滤膜采用适宜的方法灭菌； 使用时，要保证滤膜的完整性； 水溶性供试品，先用少量冲洗液湿润滤膜。油类供试品，滤膜和滤器，在使用前应充分干燥，备用。 过滤时，保持供试液及冲洗液覆盖整个滤膜表面； 冲洗滤膜时

8、，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法与方法验证相同。 1.1供试品的处理 供试品分8类，增订5种：。,2.直接接种法 供试品的处理和接种 2005版有9类供试品，其中增订3种-非澄清水溶液供试品；非水溶性供试品。-内酰胺类供试品。 直接接种法即每支（或瓶）供试品按规定量分别接入含培养细菌及真菌培养基的容器中。 除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%(表2)，用量和培养基的高度同方法验证试验； 每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。,3.培养及观察 修订：上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。 培养期间应逐日观察并记录是否

9、有菌生长。 如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2日、真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。,4.结果判断 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定； 若供试品管中任何1管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效即生长的微生物非供试品所含。 增订：当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：, 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。

10、 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。 阴性对照管有菌生长。 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。,5.重试的修订： 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。,药品无菌检查法验证示例,注射用头孢噻肟钠 （2.0g） 表1 菌落计数结果表 平皿 金黄色葡 大肠杆菌 枯草杆菌 铜绿假单 孢菌生孢 黑曲霉 白色念珠 数 萄球菌 梭菌 菌 1 68 97 77 45 100 78 85 2 59 92 63 37 100 80 72,表2 人工污染

11、大肠埃希菌结果,培养基为硫乙醇酸盐液体培养基,观察不同冲洗量，对阳性代表菌抑菌的影响,表3 人工污染金黄色葡萄球菌结果,培养基为硫乙醇酸盐液体培养基,表4 人工污染枯草杆菌结果,培养基为硫乙醇酸盐液体培养基,表5 人工污染铜绿假单孢菌结果,培养基为硫乙醇酸盐液体培养基,表6 人工污染生孢梭菌结果,培养基为硫乙醇酸盐液体培养基,表7 人工污染白色念珠菌结果,培养基为改良马丁培养基,表8 人工污染黑曲霉菌结果,培养基为改良马丁培养基,（1）表中（-）为阴性，（+）为阳性。 （2）从表2-8可以看出800ml/筒冲洗，在每100ml培养基中加入1ml青霉素酶（大于300万单位/ml）灭活残留-内酰胺酶类抗生素，可使7株阳性菌生长良好。 结论 经过试验验证，无