发酵培养基的优化方法与策略.ppt

1、发酵培养基的优化方法与策略,胡忠策 副教授 浙江工业大学 生物工程研究所 Email： Tel:Add: 杭州市潮王路18号，310032,主要内容,1 微生物培养的类型与功能（分类) 2 发酵培养基的成分及来源 3 培养基优化策略 4 实例,1 培养基类型与功能,微生物培养基：是指可供微生物细胞生长、繁殖所需的一组营养物质和原料、以及其它所必须的条件。,发酵培养基作用 （1） 满足菌体的生长、繁殖 （2） 促进产物的形成,1 培养基的类型及功能,（1）按纯度分类： -合成培养基 原料的化学成分明确、稳定。 营养单一，质量稳定； 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化

2、 -天然培养基 原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉 成分复杂、原料质量不稳定性，生产过程易波动,（2）按状态分类,固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于食用菌类生产，如香菇、白木耳等的生产。（1.6-2.0%的琼脂）,半固体培养基(软琼脂):琼脂用量为0.5%0.8% ,主要用于微生物的鉴定、观察细菌运动特征。,液体培养基: 是发酵工业大规模常用的培养基。,孢子培养基、种子培养基和发酵培养基 要求：使菌体茁壮生长，产生较多的优质孢子 基本配制要求： 营养成分不能太丰富，尤其是有机氮。 合适的水分、 pH和盐浓度,（3）按用途分类,A 孢子培养基,生产上常用孢子培养基：

3、麸皮、大米、小米培养基； 由葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基。 大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因它们含氮少、疏松、表面积大，是较好的孢子培养基。水分控制在2125。（手捏法）,种子培养基是供（孢子萌发）、菌体生长和大量繁殖的培养基。 在种子扩培过程中，各级种子培养基的成分往往不一样。 （种子培养基营养相对比较丰富） 最后一级的种子培养基的成分比较接近发酵培养基。,B 种子培养基,要求 培养基能够满足产物合成的需要。 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；质量稳定，资源 丰富，便于运输、仓藏。 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响 通气、提取、纯化及废物处理等。 杂

4、质少，发酵后所形成的副产物尽可能的少。,-发酵培养基是供菌体生长、繁殖和合成产物之用。,C 发酵培养基,2.1、碳源,2 发酵培养基的成分及来源,2.2、氮源,2.3、无机盐及微量元素,2.4、 生长因子、前体、产物促进剂,2.1、碳源,1、作用,提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分。,提供合成目的产物所必须的碳成分,2、来源,2 发酵培养基的成分及来源,常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇。,2.1.1 糖类,A 淀粉： 常用的淀粉有玉米淀粉、甘薯淀粉、小麦淀粉等， 微生物是不直接吸收淀粉的，一些微生物能要产生胞外淀粉水解酶，把淀粉分解成葡萄糖，再进行利用。因此淀粉被

5、利用的速度相对较缓慢，,A 淀粉,膨胀：淀粉是一种亲水胶体，遇水加热后，水分子渗入淀粉颗粒的内部，使淀粉分子的体积和重量增加，这种现象称为膨胀。 糊化：在温水中，当淀粉颗粒无限膨胀形成均一的粘稠液体的现象，称为淀粉的糊化。此时的温度称为糊化温度。 老化：糊化了的淀粉在室温或低于室温的条件下慢慢冷却，经过一段时间，变得不透明，甚至凝结沉淀，这种现象称为淀粉的老化。,B 葡萄糖,能被微生物快速利用， 淀粉水解制备（酶法）得到的。 DE值，是英文（dextroseequivalent）的缩写，是葡萄糖当量或葡萄糖值的意思，糖化液中还原糖含量（以葡萄糖计）占干物质的百分率。是表示，淀粉的水解程度。,葡

6、萄糖 glucose DE95-96,玉米淀粉 (30-35%, pH 6.0-6.5, Ca2+ 50 ppm),淀粉酶法水解生产葡萄糖杰能科公司,液化Liquefaction Thermostable a-Amylase (105C, 5 min),淀粉液化液 DE 10-15,糖化Saccharification， Glucoamylase (60C, pH 4.0-4.5, 24-72 h),C 糖蜜,糖蜜：生产蔗糖时的结晶母液, 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。 还含有氮化合物、无机盐、维生素、是一种价廉物美的原料。 因含有大量的胶质成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）、生物素（

7、发酵控制） ，在使用时，常要进行预处理。,不少微生物能产生脂肪酶，在脂肪酶的作用下： 油与脂肪 甘油+脂肪酸 CO2 + H2O 常用油脂有：豆油、菜油、猪油、鱼油、棉子油等。 脂肪代谢需要更多的氧气，因此发酵时要供给比糖代谢更多的氧，否则脂肪酸的积累及有机酸的积累，会引起pH下降。 油脂类比较粘稠微生物采用脂肪作为碳源时，发酵液易变粘稠。（油脂有消泡作用）,2.1.2 油与脂肪,常用的有机酸有；乳酸、柠檬酸、乙酸等 有机酸有利用常会使pH上升,尤其是有机酸盐氧化时，常伴随着碱性物质的产生，使pH进一步上升。 CH3COONa + O2 2CO2 + H2O + NaOH,2.1.3 有机酸、

8、醇,微生物能利用碳氢化合物， 如甲烷、乙烷、烷烃。 各种微生物对各种碳源的利用情况不一样，而且代谢途径也是不一样。 微生物多样性。,2.1.4 碳氢化合物,2.2 氮源,氮源主要用于构成细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。 2.2.1 有机氮源- 花生饼粉、豆饼粉、棉子饼、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。Cl 2.2.2, 无机氮源- (NH4) 2SO4 , NH4 Cl , NH4 NO3 , KNO3, NaNO3, NH3,成分复杂：除了蛋白质、多肽、氨基酸外，还有少量的糖、脂肪、无机盐、维生素等 玉米浆 Corn steep Li

9、quor 玉米淀粉生产过程中的副产品 可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸 硫、磷、微量元素等,2.2.1 有机氮源,2.2.2 无机氮源,微生物对无机氮源的利用速度比有机氮源快，因而也被称为快速利用氮源。 氮源的利用可能会引起pH值的变化 (NH4)2SO4 2NH3 + H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O +NaOH,pH,pH,生理酸性物质： 经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮（化合物）。如， (NH4)2SO4， NH4 Cl。 生理碱性物质：经微生物生理作用（代谢）后能形成碱性物质的无机氮（化合物）。如KNO3, NaNO3。 选择合

10、适的无机氮源注意事宜： 满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH,2.3 无机盐及微量元素,磷(phosphorus)、镁 (magnesium)、硫 (sulphur)、钾(potassium)、钠(sodium)、铁(iron)、氯(chlorine)、锰(manganese)、锌(zinc)、钴(cobalt)、 钙（calcium）等。 作为微生物细胞生理活性物质组成或生理活性作用的调节物。 高浓度时候，会有明显的抑制作用。,2.3 无机盐成分一般所用的浓度范围,（1）P，ATP，磷酸化酶，有利用能促进糖代谢。 许多次级代谢过程对磷酸盐浓度的承受限度比生长繁殖过程低，故必须严格控制。

11、（2）S 硫存在于细胞的蛋白质中， 是含硫氨基酸的组分和某些辅酶的活性基，如辅酶 A (coenzyme A), 谷胱甘肽等。 硫是某些产物如青霉素、头孢菌素等分子的组成部分，在培养基中加入Na2SO4等含硫化合物作硫源。,（3） Fe 铁(iron)是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分，因此铁是菌体有氧氧化必不可少的元素。 （4）Cl 一些产含氯代谢物如金霉素和灰黄霉素等的发酵中，除天然含有外，通常还需加入0.1%氯化钾。 在啤酒生产中，2060mg/ml 的氯对酶和酵母有一定的促进作用。,（5）K，Na，Ca 钠、钾离子与维持细胞的渗透压有关。钾离子是许多酶的激活剂，能促进糖代谢。

12、 钙是某些酶(如蛋白酶)的激活剂，还参与细胞膜通透性的调节。 培养基中钙盐过多时，容易形成磷酸钙沉淀。,（6）Zn，Mg，Co，Mn 锌、镁、钴、锰等是某些酶的辅基或激活剂。镁离子还可提高抗生素生产菌对自己所产生抗生素的耐性； 钴既是一些酶的激活剂，又是VB12的组成元素，发酵中加入一定量的钴盐，能使VB12的产量提高数倍。 锰对于羧化作用是必需的，糖代谢中许多酶的活性都与锰有关。,2.4 生长因子、前体、产物促进剂,(1) 生长因子 微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子 微生物自身不能合成。,有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B

13、簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。,(2) 前体 precursors,前体是指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 Example：,发酵工业中，一些常见前体物质,前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 如苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体添加过多，容易引起挥发和氧化，分解等。 因此，前体在使用过程中，常采用流加方法。,用法：前体普遍采用流加的方法， 流加有利于提高前体的转化率。,产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却

14、能提高产量的添加剂。,(3) 产物促进剂,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的（机理不详）。 有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产； 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,(3) 产物促进剂,3 培养基优化,（1）目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方。 （2）只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照他人所使用的比较适合某一类菌种、某一类产品发酵的经验配方。 （3）采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按

15、照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。,3.1 培养基优化的基本原则,注意事项： （1）菌种特性，同化能力 （2）合适的C、N比。工业发酵培养基的C、N比为100: (0.22.0) （3）合适的快速利用碳源、氮源。 （4）合适的生理性酸性与碱性 （5）pH、离子强度等,没有最好，只有更好,提高生产率,降低物耗、能耗、三废排放,提高发酵单位,缩短生产时间,价廉的原料替代，降低成本,培 养 基 优 化 目 标,方法,结果,3.2 培养基优化的基本方法,实例 1,鸡纵菌液体培养 胡忠策，郑晓冬 -微生物菌体培养的培养基优化,菌 物 系 统 2002 21（1）：98101,1-葡萄糖，

16、2-蔗糖，3-乳糖，4-赤砂糖，5-大米水解糖，6-可溶性淀粉,菌 物 系 统 2002 21（1）：98101,实例 1,1-蛋白胨，2-牛肉膏，3-酵母提取粉，4-硫酸铵，5-尿素,菌 物 系 统 2002 21（1）：98101,实例 1,实例 1,对该回归方程求偏导，得最优条件： X1，max=4.29% X2，max=0.31% X3，max=0.53% 多批实验验证，生物量为 19.8 g/L,菌 物 系 统 2002 21（1）：98101,Ymax=19.5 g/L,实例 1,实例 2 共培养体系,Noda Institute for Scientific Research (

17、NISR) Research GRANT 2005 Research Grant Antibiotic Production in Streptomyces Induced in Co-culturing System Yasuhiro IGARASHI Toyama Prefectural University,共培养体系：将致病菌与产抗生素的链霉菌共培养，从而诱导链霉菌产生不同生理活性的抗生素或者提高抗生素产量。,T. pulmonis,Antibiotic production in Streptomyces induced in co-culturing system,S.livida

18、ns S.albogriseolus S.panayensis,实例 2,Tsukamurella pulmonis-肺炎冢村菌 冢村菌属主要侵袭免疫受损患者。该属微生物感 染与慢性肺部疾病、免疫抑制（白血病，肿瘤，HIV/AIDS 感染）以及术后伤口感染有关。据报道 个别的肺部感染、坏死性腱鞘炎伴皮下脓肿、皮肤及骨感染、脑膜炎以及腹膜炎与冢村菌有关。,Antibiotic production in Streptomyces induced in co-culturing system,实例 2,能产生新的抗生素,实例 2,Antibiotic production in Streptomy

19、ces induced in co-culturing system,Alchivemycin,TPU-0043,阿克拉霉素（aclacynomycins） -别名：安乐霉素、阿拉霉素,实例 2,Antibiotic production in Streptomyces induced in co-culturing system,S. panayenis 与 T.pulmonis 共培养能提高阿克拉霉素的产量。,实例 3 诱导（不同种属之间）,Cross-species induction of antibacterial activity produced by epibiotic bac

20、teria isolated from Indian marine sponge Pseudoceratina purpurea Manmadhan Kanagasabhapathy Shinichi Nagata World J Microbiol Biotechnol (2008) 24:687691,微生物能产生次级代谢产物，保护自己免受到另一微生物的攻击。微生物种群之间存在竞争生长与抑制。,实例 3,World J Microbiol Biotechnol (2008) 24:687691,Pseudoceratina purpurea PS790，PS2菌的抑菌活性的研究。培养12h后加入竞争菌或者致病菌（S.aureus, S typhi, FB1，FB5，FB9）,Cross-species inductio