SSR分子标记剖析.ppt

1、专业综合能力训练与测试,利用SSR技术 进行玉米杂交种的纯度鉴定,2012.5,一、实验目的,玉米是我国的主要农业作物，利用SSR技术进行玉米种子纯度鉴定，已经筛选出多对可利用的引物，综合运用SSR核心引物和DNA指纹图谱，可以准确地鉴定父本、母本、混杂品种及真实杂交种，其鉴定结果与RFLP结果及系谱来源基本一致。,SSR标记的简介及原理,SSR标记的步骤及分析,SSR标记引物设计,二、SSR标记,1,2,3,SSR （simple sequence repeat）,SSR标记,简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重

2、复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200 bp以下。,SSR标记是一种通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物内在的核苷酸排布及其外在状态表现规律的技术。,1. SSR标记的简介,SSR分子标记的分子学基础,微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。在植物中通过对拟南芥、玉米、水稻、小麦等的研究表明微卫星在植物中也很丰富，均匀分布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化是非常大的 常见的二核苷酸重复单位：（AC)n、（GA)n、（AT)n 常见的三核苷酸重复单位： （AAG)n、（AAT)n,SSR分子标记的分子学基础,微卫

3、星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展了SSR标记 。,SSR分子标记原理,根据两端序列的保守性，设计引物；进行PCR，电泳分离，染色显带以检测、分析微卫星序列多态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成功鉴定的目的。 简而言之，就是通过对样本DNA多态性的分析，从而来得到样本DNA序列以及在遗传性状上的调控和差异。,SSR标记原理示意图,SSR分子标记的优势,SSR在真核生物基因组中分布广 多态

4、性丰富 其产物进行测序胶电泳分离时单碱基分辨率高、遗传信 息量大 SSR通常为显性标记，呈孟德尔式遗传 具有很好的稳定性和多态性 DNA用量少 技术要求低，成本低廉 PCR扩增的可重复性高,SSR分子标记的劣势,开发和合成新的SSR引物投入高、难度大 现有的SSR标记数量有限，不能标记所有的功能基因 SSR多态性的检测和应用很大程度上依赖PCR扩增的效果 SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等。,2. SSR分子标记的步骤,第一步：基因组DNA 提取 第二步：PCR 第三步：扩增产物电泳检测 第四步：结果分析,微卫星分子标记对18份基因型的扩增结果,引物 设计,二,三,一,从有关数据库（G

5、enBank, EMBL DDBJ等）或文章中查询,使用近缘种的引物,构建基因组文库,筛选SSR位点,3. SSR分子标记引物设计,构建基因组文库,筛选SSR位点,5锚定PCR 分离SSR标记,K可以跟任何核苷酸配对，V不能与A配对，R不能与G配对，其他核苷酸均可与它们配对。这样，VRVRV五个碱基一起构成了一个封闭碱基群。在PCR过程中，由于VRVRV不能与GA配对，该引物与模板DNA结合的时候，就不会在(GA)n重复区滑动，只会结合在如图1所示的位置上，以保证SSR位点的长度多态性不会丢失。,三、实验用品,仪器设备与耗材：PCR扩增仪、电泳仪和电泳槽、微型移液器、恒温水浴锅、凝胶成像系统等

6、，离心管、PCR管、移液器枪头等 2. 试剂 提取缓冲液：100mmol/L TrisCl，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5% SDS。 氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）。 TE缓冲液：10mmol/L TrisCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）。 SSR引物（20对）, Taq DNA聚合酶（3U/l), dNTPs（10mmol/L）,1. 材料准备： 在温室种植10种不同来源的玉米杂交种，剪取其三叶期左右嫩叶以备DNA提取之用。,四、实验操作步骤,2. DNA提取,将玉米幼叶在研钵中加液氮磨成粉状后，取约0.1g放入1.5ml离

7、心管中，立即加入0.5ml提取缓冲液（60水浴预热），摇动混匀。 60水浴保温3060min（时间长，DNA产量高），不时摇动。 加入0.5ml氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）溶液，颠倒混匀，室温下静置510 min，使水相和有机相分层。 室温下12000rpm离心5 min。 小心移取上清液至另一1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 室温下12000rpm离心5 min，去除上清液，再加入100l TE溶解沉淀。 加入1/10体积（约10l）的3mol/L NaAc及二倍体积（约300l）预冷的无水乙醇，混匀，-20放置20 min左右。 室温下12000rpm离心5 min。 去上清，用1ml 70%乙醇漂洗沉淀二次，待沉淀干燥后，重新加入100l TE溶解，-20贮存,备用。,3. PCR扩增,每小组选用3个模板，3对引物，进行如下的PCR扩增。,PCR反应程序 ： 预变性 94 5min 变性 94 30s 退火 55 30s 延伸 72 30s 共33个循环 最后72终延伸 10min,4.电泳检测： 将扩增产物在3的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色后观察结果并照相。,